جيل وثقافة الدم ثمرة غشائي خلايا من الدم المحيطي الإنسان

Summary

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Abstract

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

Introduction

حتى وقت قريب، كان يعتقد أن جيل ما بعد الولادة الأوعية الدموية الجديدة أن تحدث بشكل حصري من خلال عملية تعرف باسم الأوعية الدموية، الذي يعرف بأنه تنتشر سفن جديدة من الخلايا البطانية للأوعية موجودة من قبل. ¹ هذه العملية تتناقض من تكون الأوعية، أو تشكيل دي نوفو الأوعية الدموية من أسلاف البطانية، الذي كان يعتقد أن يحدث حصرا أثناء التطور الجنيني. ² ومع ذلك، وقد حددت الدراسات الأكثر حداثة وعزل تعميم الخلايا الاصلية البطانية (EPCS) في الدم المحيطي الكبار. هذه الخلايا تمتلك القدرة على التمايز إلى خلايا البطانية ناضجة في الثقافة ويعتقد على المشاركة في تكون الأوعية بعد الولادة. ^3،4

بروتوكولات للعزلة وتوسيع هذه EPCS وعادة ما تشمل ثقافة الخلايا الطرفية وحيدة النواة في الدم (PBMNCs) في وسائل الإعلام التي تحتوي على عوامل النمو البطانية، بما في ذلك vasculعامل AR البطانية النمو (VEGF)، وعامل نمو الخلايا الليفية-2. ^5-8 الثقافات EPC تنتج مجموعة متنوعة من أنواع مختلفة من الخلايا بشكل كبير. الثقافات الأولية (<7 أيام) ويغلب عليها نوع من الخلايا الوحيدات، والمعروف في الأدب بأنه "في وقت مبكر" EPCS. على الرغم من اسمها، وهذه الخلايا تعبر عن CD14 الوحيدات علامة، هي سلبية للCD34 السلف علامة والتعبير عن مستويات الحد الأدنى فقط من الكلاسيكية البطانية علامات CD31 وVEGF مستقبلات 2 (VEGFR2). ⁵ الثقافة استمرار يثير سكان الثانوي من الخلايا، المعروفة باسم EPCS أواخر ثمرة أو الخلايا البطانية ثمرة الدم (BOECs)، والتي تظهر المستعمرات سرية اعتبارا من خلايا تشبه الخلايا البطانية. وخلافا للEPCS مبكرة الوحيدات، BOECs، والتي أيضا تم استدعاء مستعمرة تشكيل الخلايا البطانية (ECFCs)، الخلايا البطانية ثمرة أو الخلايا البطانية في وقت متأخر من ثمرة، يحمل التشكل المرصوفة بالحصى التي هي الحال في الطبقات الوحيدة الخلية البطانية وتشبه إلى حد كبير في علامة السطح5 والتعبير الجيني ⁹ إلى أن تنضج الخلايا البطانية.

توليد خلايا تشبه الخلايا البطانية من الدم المحيطي يوفر العديد من المزايا، وخاصة لدراسة الخلل الخلايا البطانية المرتبطة اضطرابات الأوعية الدموية مثل ارتفاع ضغط الدم الرئوي الشرياني (PAH) ¹⁰ أو فون ويلبراند المرض. ¹¹ قبل توافر BOECs، البطانية لا يمكن إلا أن تكون مشتقة من خلايا أجهزة explanted في وقت الوفاة أو زرع الأعضاء، أو معزولة من الوريد السري عند الولادة. هذا انخفاض توافر يمثل قيدا خطيرا على فهم بيولوجيا الخلايا البطانية من المرضى الذين يعانون من اضطرابات القلب والأوعية الدموية، وكذلك التفاعلات بين الخلايا البطانية وإما خلايا الدم أو الخلايا الجدارية. وعلاوة على ذلك، عزل وزراعة السكان نقية من الخلايا البطانية من هذه المصادر يشكل تحديا فنيا والخلايا التي يحصل عليها هذه الأساليب يحمل سوى يميتالقدرة التكاثري د. لذا BOECs تقديم بديل قيمة للعزلة وثقافة من الخلايا البطانية الأولية المستمدة من المريض.

بالإضافة إلى المختبر في طلباتهم، BOECs أيضا يمكن أن تكون مفيدة في علاج ذاتي زرع الخلايا. وتشمل هذه التطبيقات على حد سواء زرع البطانية خلية لتعزيز اتساع الأوعية الدموية (انظر ¹² والمراجع فيه)، فضلا عن توليد الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs). ¹³ iPSCs BOEC المشتقة يمكن أن تستخدم لنمذجة المرض وتوفر إمكانات هائلة مثل الانطلاق المواد اللازمة لعلاج الخلايا ذاتي. BOECs برمجة أسرع وبكفاءة أعلى من الخلايا الليفية الجلد. وعلاوة على ذلك، BOECs أيضا السماح لتوليد iPSCs أن تكون خالية من العيوب النمط النووي، الذي هو سمة أساسية من سمات أي تكنولوجيا من شأنها أن تكون مناسبة لتطبيقات متعدية. القدرة على توليد iPSCs من عينة دم المريضيسوتو يلغي الحاجة لخزعة الجلد وتوليد الخلايا الليفية الجلد، مما يسهل توليد الخلايا من المرضى الذين يعانون من اضطرابات التئام الجروح، أو الصغار جدا.

بروتوكول المفصلة أدناه، التي وافقت عليها والتي تتم وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الخدمة أخلاقيات القومي للبحوث (شرق انجلترا)، يوفر طريقة بسيطة وموثوق بها لتوليد BOECs مع كفاءة أكبر من 90٪ من حجم صغير نسبيا (60 مل) من الدم المحيطي. هذه الخلايا هي التكاثري للغاية ويمكن passaged مرارا وتكرارا، مما يسمح لتوليد مئات الملايين من الخلايا من عينة دم واحدة.

Protocol

ويرد التخطيطي للبروتوكول الجيل BOEC في الشكل 1. 1. جمع الدم والتدرج الكثافة الطرد المركزي لكل الجهات المانحة، إضافة 3 مل من سترات الصوديوم إلى كل من اثنين من 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية. جمع 60 مل من الدم عن طريق بزل الوريد وإضافة 30 مل لكل أنبوب. عكس بلطف 2-3 مرات لخلط. استخدام اقل من 40 مل من الدم في البروتوكول، مع وحدات التخزين سترات تبعا لذلك. ملاحظة: من الضروري أن تتم معالجة عينات الدم في غضون 2 ساعة من جمعها. تأخر تجهيز نتائج فحص الدم في انخفاض ملحوظ في العائد مستعمرة ثمرة. إعداد أنابيب مخروطية جديدة تحتوي على كثافة التدرج الطرد المركزي المتوسطة التي كتبها قلب أول الزجاجة عدة مرات لخلط. في غطاء العقيمة، إضافة 15 مل من التدرج الكثافة الطرد المركزي المتوسطة في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل (1 أنبوب لكل 10 مل من الدم، 6 أنابيب في المانحة). تمييع الدم 1: 1 مع الفوسفات Dulbecco ل-Buffered المالحة (DPBS). إمالة الأنبوب الذي يحتوي على الطرد المركزي متوسطة الكثافة التدرج إلى زاوية 20 درجة مع سطح العمل. باستخدام المساعدات ماصة و25 مل ماصة المصلية، طبقة ببطء 21 مل من الدم المخفف على أعلى من المتوسطة بإضافة الدم تدريجيا جدار أنبوب مائل. ملاحظة: وسوف نفعل ذلك تقليل اختلاط الدم مع طبقة التدرج الكثافة وسوف تنتج معطف الشهباء تشديد، فضلا عن العائد المحسنة. عينات الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 35 دقيقة في RT مع دواسة البنزين والفرامل خارج. خلال هذه الفترة الطرد المركزي، والبدء في طلاء الكولاجين هو مفصل في الخطوات 2،1-2،4. ضمان الانتهاء من هذه الخطوات قبل الشروع في الخطوة 3.1. 2. الكولاجين طلاء من T-75 قارورة وإعداد الثقافة المتوسطة ملاحظة: إجراء الخطوات التالية في غطاء ثقافة الخلية. إعداد / مل من محلول الكولاجين 50 ميكروغرام عن طريق تمييع الأسهم تايالمؤسسة العامة I الكولاجين في 10 مل من حمض الخليك 0.02M مثال: لمخزون الكولاجين بتركيز 4.05 ملغ / مل، إضافة 123.5 ميكرولتر من الكولاجين إلى 10 مل من حمض الخليك 0.02 M. تصفية العقيمة الكولاجين تعليق قبل استخدامها. باستخدام ماصة المصلية، إضافة 7.5 مل من محلول الكولاجين إلى T-75 خلية ثقافة القارورة. يعطي هذا الحجم 5 ميكروغرام الكولاجين / سم 2 (أو 375 ميكروغرام / قارورة). معطف قارورة لمدة 1 ساعة على RT. إعداد المتوسطة نمو بطانة المستخدمة لتوليد BOEC من خلال استكمال البطانية المتوسطة القاعدية مع مكملات عامل نمو المقدمة من قبل الشركة المصنعة. إضافة كافة الملاحق، ولكن لا تضيف مصل. لإعداد 15 مل من الجيل BOEC المتوسطة، إضافة 2.5 مل من تعريف مصل بقري جنيني (FBS) إلى 12.5 مل من متوسط ​​النمو البطاني التي تحتوي على ملاحق عامل النمو. المضي قدما في الخطوات الموضحة في القسم 3. بعد فترة طلاء 1 ساعة، نضح الحل الكولاجين ويغسل حامض الخليك المتبقية قبل pipettingفي 10 مل DPBS. نضح قبالة DPBS وكرر هذه الخطوة يغسل مرة أخرى. إذا كان تعليق الخلية التي تم الحصول عليها خلال الخطوة 3.3 ليست مستعدة لتصفيح في هذا الوقت، إضافة 5ml من الجيل BOEC المتوسط ​​إلى القارورة للحفاظ على طلاء الكولاجين من الجفاف التدريجي. 3. جمع وطلاء من PBMNCs بعد الطرد المركزي التدرج الكثافة هو موضح في الخطوة 1.4، وجمع بعناية طبقة معطف الشهباء باستخدام معقم نقل البلاستيك ماصة. جمع من معطف الشهباء ينبغي أن تسفر حوالي 20 مل من تعليق خلية والبلازما من كل أنبوب. تجنب نقل متوسطة الكثافة التدرج. تمييع تعليق خلية وحيدة النواة 1: 1 في DPBS وعكس إلى المزيج. أجهزة الطرد المركزي في RT لمدة 20 دقيقة في 300 x ج مع الفرامل ودواسة البنزين كحد أقصى. بعد الطرد المركزي، ونضح الخلايا طاف و resuspend عن طريق إضافة 1 مل من الجيل BOEC المتوسط ​​إلى كل بيليه وpipetting صعودا وهبوطا بشكل متكرر. خلية تجمع تعليق لد أعلى حتى الحجم الإجمالي إلى 10 مل مع المتوسطة المتبقية. للحصول على تقدير من إجمالي عدد الخلايا، عينة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وتمييع 50X مع 490 ميكرولتر من محلول الترك، والتي سوف ليز خلايا الدم الحمراء. عد عينة 10 ميكرولتر من تعليق خلية المخفف باستخدام haemocytometer. ملاحظة: 60ML الدم ينبغي أن تسفر حوالي 100-150 × 10 6 خلايا الدم البيضاء للطلاء. لوحة تعليق الخلية بأكملها في عملية واحدة، المغلفة الكولاجين T-75 قارورة، أعلى متابعة حجم المتوسط ​​إلى 15ML / قارورة والثقافة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO 2. خلايا مطلي في هذا الوقت تمثل مرور 0. ملاحظة: من الممكن تجميد PBMNCs معزولة قبل العزلة BOEC من أجل استخلاص BOECs في وقت لاحق أو لنقل PBMNCs إلى مختبر مختلف حيث يمكن إنشاء BOECs. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن PBMNCs تجميد يمكن أن تقلل من كفاءة العزل BOEC. Sه ه القسم 8 أدناه للحصول على الأسلوب. الثقافة خلية 4. على المدى الطويل تغيير المتوسطة كل أيام 2 وذلك بإضافة 15 مل من الطازجة المتوسطة الجيل BOEC (5: 1 خليط من البطانية المتوسطة نمو الخلايا وتعريف FBS). لعطلة نهاية الأسبوع، والتغيرات المتوسطة يمكن أن يتأخر إلى كل 3 أيام. ملاحظة: يجب أن تظهر المستعمرات ثمرة ما بين 7 و 14 أيام للثقافة. مراقبة قارورة الثقافة BOEC في أيام 7-14 لظهور المستعمرات ثمرة. تحديد المستعمرات كمجموعات دائرية من الخلايا اظهار مورفولوجيا الحصوه البطانية الكلاسيكية. مرة واحدة يتم تحديد مستعمرة أو مستعمرات متعددة في قارورة، تواصل مع التغييرات المتوسطة والسماح المستعمرات ليصل إلى ما يقرب من 1000 حتي 2000 خلية لكل مستعمرة قبل الركض. تحديد عدد الخلايا في مستعمرة من خلال تقدير البصري الخام. ملاحظة: كدليل، فمن المعتاد أن مرور المستعمرات ثمرة الأولية بعد أسبوع من تحديد أول مستعمرة ثمرة. <لى> خلايا الممر من قبل الشطف القوارير مرتين مع 10 مل من DPBS. إضافة 5 مل من 1X التربسين-EDTA واحتضان في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد 5 دقائق، تحييد التربسين مع 10 مل من المتوسط ​​(التي تحتوي على FBS) وجلب الخلايا في تعليق مع pipetting لالمتكررة. تعليق الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق، resuspend في 15 مل من الجيل BOEC الطازجة المتوسطة وصفيحة تعليق خلية بأكمله في جديدة T-75 قارورة (التي تمثل الممر 1، P1). مطلوب أي طلاء الكولاجين. مواصلة التغييرات المتوسطة كما هو موضح أعلاه حتى الخلايا هي متكدسة (حوالي 3-5 × 10 6 خلايا في قارورة). مرة واحدة متموجة، خلايا مرور كما هو موضح في الخطوة 4.3. ملاحظة: من مرور 2 فصاعدا، والخلايا لم تعد تتطلب جيل BOEC المتوسطة ويمكن تربيتها في البطانية المتوسطة نمو الخلايا و10٪ معيار الحرارة المعطل FBS. الكولاجين طلاء يمكن أن تستخدم خطوة اختيارية للمضي قدما، كما أن هناك أدلة تشير إلى أن وجود الكولاجين يمكن أن تعزز مؤيد للBOECأسعار أوجه. لاستمرار الركض، لوحة لا يقل عن 750،000 الخلايا في T-75 قارورة كما يمكن أن كثافة الخلية منخفضة تتسبب في BOECs لوقف تكاثر. 5. تجميد والثقافات ذوبان BOEC يعرض للتريبسين الخلايا كما هو موضح في القسم 4.3 وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. نضح في وطاف resuspend في 10 مل من المتوسط. هذا لا يتطلب البطانية المتوسطة نمو الخلايا. سوف DMEM مع FBS القياسية 10٪ تكون كافية. جمع عينة 10 ميكرولتر من تعليق خلية لإجراء تعداد خلايا اليدوي باستخدام haemocytometer. الطرد المركزي مرة أخرى و resuspend في الخلايا 2×10 6 / مل في الجليد الباردة المتوسطة الحفظ بالتبريد (40٪ DMEM مع 50٪ FBS و 10٪ DMSO). إضافة 0.5 مل (10 6 خلايا) إلى كل قارورة، قارورة مكان في الجليد الباردة الأيزوبروبانول سفينة الحفظ بالتبريد وضعها في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل قبل أن ينتقل إلى النيتروجين السائل. لا تترك الخلايا في -80 درجة مئوية لمدة أكثر من 24 ساعة. </lI> لذوبان الجليد الخلايا، إضافة 10 مل من المتوسط ​​قبل تحسنت إلى 15 مل المخروطية أنبوب الطرد المركزي. ملاحظة: عندما يذوب من مرور 1 الخلايا، ذوبان الجليد في البطانية المتوسطة نمو الخلايا تستكمل مع 20٪ تعريف FBS ل 2 أيام الأولى بعد الذوبان. وهذا يؤدي إلى العزلة الخلية أكثر استقرارا للمضي قدما. إزالة الخلايا من النيتروجين السائل وذوبان الجليد في 37 ° C حمام الماء مع الإثارة لطيف حتى لا يتبقى سوى الكريستال الجليد الصغيرة في القارورة. إضافة محتويات القارورة قطرة من الحكمة لأنبوب الطرد المركزي مخروطي الشكل وتدور باستمرار في 300 x ج لمدة 5 دقائق. طاف نضح و resuspend الخلية بيليه في 10 مل EGM-2MV + 10٪ FBS. إضافة إلى T-75 قارورة وأعلى حتى المتوسطة إلى 15 مل. 6. توصيف BOECs بواسطة التدفق الخلوي مرة واحدة وقد تم السماح للمستعمرات BOEC هو موضح في القسم 4 في التوسع، ويعرض للتريبسين الخلايا كما هو موضح في القسم 4.4 و resuspend بتركيز 10 6 خلايا لكل مل العازلة تلطيخ (DPBS الطرافةح 2٪ FBS و 2 ملي EDTA). الجمع بين 10 5 الخلايا مع الأجسام المضادة تألقي مترافق الموجهة ضد CD45، CD14، CD34، CD31 (استخدام جميع في 01:20 تمييع) أو VEGFR2 (تمييع 01:10) (انظر الجدول 1 للاطلاع على التفاصيل كاملة). احتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام. غسل الخلايا مع 1 مل تلطيخ العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. طاف نضح و resuspend في 400 ميكرولتر العازلة تلطيخ للتحليل. إبقاء الخلايا في 4 درجات مئوية، ومحمية من الضوء قبل التحليل. إجراء تحليل cytometric على الكريات مجهزة للكشف عن الأجسام المضادة مترافق fluorescently المستخدمة في الفحص. استخدام عينة BOEC غير ملوثين لتحديد السكان الخلية على الكريات عن طريق ضبط الفولتية إلى الأمام والجانب مبعثر، وكذلك الفولتية للقنوات FITC وAPC. تحديد النابضة عتبات استخدام الخلايا نمط إسوي الملون لكل تألقي. تقييم الإيجابية لكل علامة سطح الخلية على أساس presenc(ه) تحولا الذروة في كثافة مضان مقابل isotype السيطرة لتألقي يجري تحليلها. 7. توصيف BOECs بواسطة مناعي المجهر BOECs وحة في جيدا 24، مسطحة القاع لوحة زراعة الأنسجة دون coverslips في كثافة 5 × 10 4 خلايا في 500 ميكرولتر من البطانية المتوسطة نمو الخلايا + 10٪ FBS لكل بئر وترك على الالتزام وينمو بمعدل 37 المعطل الحرارة ° C، 5٪ CO 2 حتى الخلايا تغطي 70-80٪ على الأقل من مساحة سطح كل بئر (تقديرات confluency عن طريق التفتيش البصري تحت microsope الخفيفة). غسل الخلايا في كل بئر لمدة 5 دقائق مع 1 مل من DPBS. إصلاح الخلايا O / N عند 4 درجات مئوية مع 500 ميكرولتر من 4٪ محلول امتصاص العرق في DPBS. غسل الخلايا لمدة 3 × 5 دقائق مع 1 مل من DPBS لكل بئر. إضافة وإزالة DPBS باستخدام ماصة والشافطة، على التوالي. Permeabilize الخلايا لمدة 3 × 10 دقيقة مع 0.2٪ بوليسوربات 20 في DPBS. </li> احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة على RT في عرقلة العازلة التي تحتوي على 10٪ FBS في DPBS. خلايا وصمة عار في 4 درجات CO / N في 300 ميكرولتر من العازلة الضد التخفيف (0.1٪ ألبومين المصل البقري في DPBS) التي تحتوي على الأجسام المضادة الأولية الموجهة ضد CD34 (10 ميكروغرام / مل)، CD144 (1: 300) أو VWF (1: 250) . انظر الجدول رقم 1 للحصول على التفاصيل كاملة. يغسل الأجسام المضادة الأولية غير منضم لمدة 5 × 10 دقيقة مع DPBS. احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة على RT مع الأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى المناسب، كما هو مفصل في الجدول 1 (في كل 1: 200). يغسل الأجسام المضادة الثانوية غير منضم لمدة 5 × 10 دقيقة مع DPBS. احتضان الخلايا مع 1 ميكروغرام / مل 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) في DPBS لمدة 10 دقيقة في RT. غسل الخلايا مع DPBS ل3 × 5 دقيقة أخرى. خلايا الصورة في التكبير 100X باستخدام مجهر مقلوب مجهزة مصدر ضوء خارجي لمضان الإثارة، والتقاط الصور باستخدام إرفاقكاميرا رقمية إد لتحليلها لاحقا دون اتصال. 8. التجميد والذوبان PBMNCs في نهاية المرحلة 3.2 بعد الطرد المركزي، ونضح المتوسطة وتعطيل بيليه الخلية مع pipetting لتكرار صعودا وهبوطا باستخدام طرف P1000 ماصة يدويا. إضافة 1 مل من تجميد المتوسطة، و 90٪ مصل و 10٪ DMSO، مع التأكد من المزيج برفق لإنتاج تعليق خلية. نقل تعليق خلية إلى cryovial وتجميد والذوبان كما هو موضح في القسم 5.

Representative Results

عزل الشهباء الخلايا وحيدة النواة معطف من 60 مل من الدم وعادة ما ينتج 100-150×10 6 مجموع خلايا الدم البيضاء. عندما مطلي في واحدة T-75 قارورة، وعدد كبير من الخلايا في تعليق خلية unlysed يجعل من الصعب حل الخلايا الملتصقة الفردية باستخدام brightfield المجهري. تغييرات المتوسطة المتكررة تؤدي إلى إزالة الخلايا غير ملتصقة وتسمح لتصور من السكان ملتصقة من وحيدي "في وقت مبكر" EPCS. في يوم 7، سوف تحتوي على T-75 حوالي 7×10 6 من هذه الخلايا الملتصقة ممدود. من يوم 7-14، يجب أن تظهر مستعمرات BOECs داخل قارورة (الشكل 2A). لأول مرة تظهر المستعمرات كما 3-5 الخلايا المجاورة. عدد مستعمرة ثمرة يمكن أن تختلف 1-10 المستعمرات في 60 مل من الدم. عموما، والجهات المانحة الأصغر سنا (أي 20-25 سنة) تميل إلى إنتاج عدد أكبر من المستعمرات ثمرة، والتي تظهر أيضا في الثقافة في وقت سابق.BOECs تتكاثر من هذه المجموعة المركزية من الخلايا لتشكل مستعمرات دائرية تتكون من عدة مئات من الخلايا. الخلايا داخل هذه المستعمرات يحمل مورفولوجيا الحصوه البطانية الكلاسيكية. فمن الأفضل أن مرور المستعمرات الأولية عندما كانت تحتوي على حوالي 1000 خلية لكل مستعمرة. وعادة ما تصل المستعمرات ثمرة هذا الحجم بعد 7 أيام المظهر الأصلي في الثقافة. مرة واحدة و passaged المستعمرات الأصلية في جديدة T-75 قارورة، ينبغي لها أن تتكاثر لتشكيل أحادي الطبقة متموجة (3-5×10 6 خلايا في قارورة) خلال 5 أيام أو أقل (الشكل 2B). في نسبة صغيرة من العزلة (<10٪)، تفشل المستعمرات ثمرة لتظهر أو لا تتكاثر بما فيه الكفاية بعد هذه الخطوة الركض الأولية. BOECs التي تظهر انخفاض انتشار بعد أول الركض بها نادرا ما تستمر لتصبح العزلة BOEC مستقرة، وكثيرا ما وقف المتكاثرة في غضون شهرين إلى ثلاثة مقاطع. وحيديEPCS الأولى الواردة في الثقافات BOEC غير قابلة للالتكاثري وعادة ما يتم تطهيرها من الثقافات في غضون 1-2 الممرات. هو إزالة هذه الخلايا في وقت مبكر يرجع إلى موت الخلايا، فشل الخلايا الأولى لإعادة الالتزام بعد الركض والتخفيف من EPCS غير التكاثري في وقت مبكر مع الركض المتكرر. إما أن مرور 1 الخلايا يتم passaged كذلك في الثقافة أو تجميد أسفل لاستخدامها لاحقا. مرة واحدة يتم إنشاء العزلة مستقرة، والخلايا يمكن passaged بمعدل 1 متكدسة قارورة إلى 3-5 جديدة T-75 قوارير حتى مرور 8 أو 9 قبل أن يصبح هادئة. مرة أخرى، كثافة الخلية هي الحاسمة في جميع أنحاء الثقافة. في تجربتنا، ينبغي مطلي ما لا يقل عن 750،000 الخلايا في T-75 قارورة، وأقل كثافة الخلية يمكن أن يسبب توقف نمو. وعلى الرغم من إمكانية التكاثري عالية من BOECs، وينبغي أيضا عدم السماح الخلايا لتصبح overconfluent (أي.،> 5X10 6 خلايا في قارورة) وهذا يمكن أن يسبب CONVERS أيون من BOECs إلى النمط الظاهري غير التكاثري. ونقترح أن أي خلية وصفها بأنها ينبغي أن BOEC عرض سطح الخلية المناسب وتلطيخ الخلايا البطانية للعلامات. لا يمكن أن يتحقق توصيف BOECs التدفق الخلوي (الشكل 3) أو المجهري مضان (الشكل 4)، وبعد تلطيخ لعلامات الخلايا البطانية نموذجية. BOECs إيجابية لCD31 علامات سطح البطانية وVEGFR2 وهي سلبية للCD14 الوحيدات علامة وعموم الكريات البيض علامة CD45. كما posess BOECs الهيئات ويبل-بالادي وبالتالي التعبير عن عامل فون ويلبراند (VWF) كما منفصلة، ​​وتلطيخ حشوية منقط. خلافا لغيرها من أنواع الخلايا البطانية ناضجة، مثل الشريان الرئوي أو الخلايا البطانية الأورطي، BOECs أيضا أن أعرب عن السلف وتفعيل علامة CD34 على سطحها. ftp_upload / 53384 / 53384fig1.jpg "/> الشكل 1. رسم تخطيطي من BOEC بروتوكول جيل. يتم عزل الخلايا وحيدة النواة في الدم المحيطي من الدم الوريدي قبل التدرج الكثافة الطرد المركزي ومثقف على لوحات المغلفة الكولاجين في البطانية المتوسطة النمو التي تحتوي على تعريف FBS. تظهر المستعمرات BOEC في غضون 7-14 أيام للثقافة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2. صور Brightfield الثقافات BOEC التمثيلية. (A) تظهر المستعمرات ثمرة في الثقافات بين أيام 7 و 14. المستعمرات الحالية إلى مجموعات من الخلايا مثل الخلايا البطانية، التي يتم ترتيبها في أحادي الطبقة المرصوفة بالحصى وتتكاثر شعاعيا الخروج من نقطة مركزية. المحيطة المستعمرات ثمرة هي أحادية تمسكاإختر التصميم الخلايا التي تشكل الغالبية العظمى من الخلايا في الحضارات القديمة. هذه الخلايا، التي سبق وصفها بأنها "في وقت مبكر" الخلايا الاصلية البطانية، لديها التشكل مثل مغزل والتعبير عن علامة CD14 الوحيدات. (B) وبعد الركض، وBOECs التكاثري للغاية تولي الثقافات، والخلايا الوحيدات غير التكاثري إما تموت أو تفشل في إعادة نعلق بعد الركض. مقياس شريط 250μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3. توصيف BOECs التدفق الخلوي. تم trypsinized BOECs وملطخة الأجسام المضادة isotype السيطرة fluorescently مترافق (الرمادي شغل الذروة) أو الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات سطح معينة (خط أحمر). علامات سطح لتوصيف cytometricوتشمل العلامات المكونة للدم CD45 CD14 و، علامات البطانية CD31 وVEGFR2 وprogentior والبطانية تنشيط علامة CD34. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 4. مناعي تلطيخ BOECs للعلامات الخلايا البطانية. الصور المناعي التمثيلية للBOECs immunostained مع الأجسام المضادة الموجهة ضد البطانية علامة سطح الخلية CD144 (VE كادهيرين، أعلى اللوحة اليمنى) وبروتين سكري الدم عامل فون ويلبراند (VWF، لوحة اليمنى السفلى) . وأظهرت المقابلة لوحات تبين تلطيخ دابي النووي إلى اليسار. مقياس شريط 50μm. لCD144. الرجاء انقر هنا لعرض أكبرنسخة من هذا الرقم.

Discussion

We present a detailed protocol that allows for the robust and efficient derivation of BOECs from adult peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs). Our protocol includes two important refinements that represent advances on previous methods of BOEC isolation.^14-16 These include the absence of heparin in the initial PBMNC culture medium and the use of defined, embryonic stem cell-qualified serum. This latter refinement is of particular importance. Embryonic stem cell (ESC)-qualified serum is a more consistent grade of serum and, although it is not known yet what component(s) are enriched in the serum that benefit BOEC isolation, the impact of this defined serum on the efficiency of BOEC generation is clear in our hands. In addition, we have also had success in isolating BOECs using human serum, thereby allowing for the generation of BOECs for clinical translation. In our hands, this refined protocol results in the successful isolation of stable BOEC cultures from greater than 90% of donors, making it one of the most reliable BOEC generation methods reported thus far. Although the use of particular sera is critical to BOEC generation, it also represents a primary limitation of the current protocol. Future improvements to the technique could include the generation of these cells in serum-free, defined culture conditions.

Critical Steps in the protocol include processing blood samples as soon as possible after collection, complete harvesting of the buffy coat cells after density gradient centrifugation and the timely passaging of initial colonies from P0 to P1. This passaging step is critical to establishment of a stable isolation. Like other endothelial cells, BOECs appear to be very sensitive to plating density. If the plating density after passaging is too low, the BOECs will not proliferate. Conversely, if the colonies are allowed to become overconfluent before passaging, the cells will also cease to proliferate and have the tendency to convert into an elongated, mesenchymal cell phenotype. If few colonies appear from days 7 to 14, or if the colonies are small in size, troubleshooting can include increasing cell density by passaging P0 colonies into a T-25 flask instead of a T-75.

Once the technique is mastered, the resultant BOECs can be used in several applications, including in vitro studies of endothelial cell biology, disease modeling and drug screening, as well as in vivo cell transplantation therapies. An important consideration for the development of any cell therapy process is to use cells that are free from pathogenic mutations. We have previously shown that BOECs isolated using our protocol possess genomes that are free from copy number variations and are thus representative of the individual from which they were collected. In addition, we have also demonstrated that the majority of BOEC-derived iPSC lines are free from copy number variations.¹³ This contrasts with previous reports of copy number variation in fibroblast-derived iPSCs. To date, these cells remain the only iPSCs for which this degree of genomic fidelity has been reported. This feature is important for the field of iPSC biology and the use of iPSCs in disease modeling, drug screening and future cell transplantation therapies.

Materials

For blood collection
60 mL syringe with luer-lok tip	BD	309653
19G Surflo Winged Infusion Set	Terumo	SV-19BL
50 mL conical centrifuge tube	StarLab	E1450	2 per donor
Sodium Citrate	Martindale Pharmaceuticals	270541
Name	Company	Catalog Number	Comments
For buffy coat isolation
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+)	Sigma-Aldrich	D8537
Sterile wrapped plastic transfer pipettes	Appleton Woods	KC231
Turk’s Solution	Millipore	1.093E+09
Name	Company	Catalog Number	Comments
For cell culture, passaging and freezing cells
Type 1 Collagen (derived from rat tail)	BD Biosciences	35-4236
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+)	Sigma-Aldrich	D8537
0.02M Acetic Acid	Sigma-Aldrich	A6283	prepared in reagent grade water
Endothelial Growth Medium-2MV (containing Bullet Kit, but not serum)	Lonza	CC-3202	Note: It is essential that the medium does not contain heparin.   Do not use EGM-2.
Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined	Hyclone	SH30070
10x Trypsin EDTA	Gibco	T4174	Dilute to 1x in PBS prior to use
Heat Inactivated FBS	Gibco	10500-064
DMEM	Gibco	41965-039
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container	Sigma-Aldrich	C1562
Name	Company	Catalog Number	Comments
For flow cytometric characterization
FITC-conjugated mouse anti-human CD14	BD Biosciences	555397	Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD31	BD Biosciences	555445	Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human CD34	BD Biosciences	555824	Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34 Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD45	BD Biosciences	560976	Mouse IgG1k, Clone: HI30 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2	R&D Systems	FAB357A	Mouse IgG1, Clone: 89106 Dilution: 1:10
FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control	BD Biosciences	555748	Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control	BD Biosciences	555751	Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control	R&D Systems	IC002A Dilution: 1:10	Clone: 11711
EDTA, 0.5M solution	Sigma-Aldrich	E7889
Name	Company	Catalog Number	Comments
For immunofluorescent microscopy
Corning Costar 24-well tissue culture plate	Sigma-Aldrich	CLS3527
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Polysorbate 20	Sigma-Aldrich	P2287
Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody	R&D Systems	MAB72271	Clone 756510, IgG1, use at 10 μg/ml
Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144)	R&D Systems	AF938	Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300
Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF)	Abcam	ab154193	Clone EPSISR15, use at 1:250
Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-21202	Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200
Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11055	Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate	Life Technologies	A-10042	Polyclonal,  2 mg/ml, 1:200
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542	use at 1 μg/ml