Génération et de la Culture du sang excroissance des cellules endothéliales de sang périphérique humain

Summary

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Abstract

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

Introduction

Jusqu'à récemment, la génération post-natal de nouveaux vaisseaux sanguins était censé se produire exclusivement par l'entremise d'un processus appelé angiogenèse, définie comme la germination de nouveaux vaisseaux à partir des cellules endothéliales des vaisseaux préexistants. ¹ Ce processus contraste de la vasculogenèse, ou la formation de novo de vaisseaux sanguins à partir de progéniteurs endotheliales, qui a été supposée se produire exclusivement pendant l'embryogenèse. ² Cependant, des études plus récentes ont identifié et isolé circulant cellules progénitrices endothéliales (EPCs) dans le sang périphérique des adultes. Ces cellules ont la capacité de se différencier en cellules endothéliales matures en culture et sont soupçonnés de participer à la vasculogenèse postnatale. ^3,4

Les protocoles pour l'isolement et l'expansion de ces EPC impliquent généralement la culture de cellules périphériques mononucléaires de sang (les PBMNCs) dans des milieux contenant des facteurs de croissance endothéliaux, y compris vascular facteur de croissance endothelial (VEGF) et le facteur de croissance des fibroblastes-2. ^8/5 cultures EPC produisent une variété de types de cellules très différents. Les cultures initiales (<7 jours) sont dominées par un type de cellule monocytaire, connu dans la littérature comme «précoces» EPC. Malgré leur nom, ces cellules expriment le CD14 marqueur de monocyte, sont négatives pour le CD34 de marqueur de cellules progénitrices et expriment des niveaux minimes de la classique marqueurs endothéliaux CD31 et récepteur de VEGF 2 (VEGFR2). ⁵ culture continue donne lieu à une population secondaire de cellules, connu comme EPC fin excroissance ou cellules endothéliales excroissance de sang (BOECs), qui apparaissent comme des colonies discrètes de cellules endothéliales-like. Contrairement aux premiers EPC monocytaires, BOECs, qui ont également été appelé formant des colonies des cellules endotheliales (les CPEF), des cellules endotheliales excroissance ou des cellules endothéliales de fin de excroissance, présentent la morphologie pavée qui est typique des monocouches de cellules endotheliales et sont hautement similaires en marqueur de surface5 et l'expression du gène ⁹ à mûrir les cellules endothéliales.

La génération de cellules endotheliales en forme à partir de sang périphérique offre plusieurs avantages, en particulier pour l'étude de la dysfonction des cellules endotheliales associées à des troubles vasculaires tels que l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) ¹⁰ ou maladie de von Willebrand. ¹¹ Avant la disponibilité de BOECs, endothelial cellules ne pouvaient être obtenues à partir d'organes explantées au moment du décès ou de la transplantation d'organes, ou isolés à partir de la veine ombilicale à la naissance. Cette disponibilité réduite représentée une sérieuse limitation à comprendre la biologie des cellules endotheliales à partir de patients souffrant de troubles cardio-vasculaires, ainsi que les interactions entre les cellules endothéliales et soit des cellules de sang ou de cellules murales. En outre, isolement et de culture une population pure de cellules endothéliales à partir de ces sources est techniquement difficile et les cellules obtenus par ces méthodes présentent seulement une limited capacité proliférative. BOECs offrent donc un substitut précieux pour l'isolement et la culture de cellules endothéliales primaires provenant de patients.

En plus de leurs applications in vitro, BOECs sont également potentiellement utiles dans des thérapies de transplantation autologue de cellules. Ces applications comprennent à la fois la transplantation de cellules endotheliales, de promouvoir la néovascularisation (voir ¹² et les références qui y sont citées), ainsi que la génération de cellules souches pluripotentes induites (CSPi). ¹³ iPSCs BOEC dérivés peuvent être utilisés pour la modélisation de la maladie et offrent un immense potentiel que le départ matériel pour les thérapies cellulaires autologues. BOECs reprogrammer plus rapidement et avec une plus grande efficacité que les fibroblastes de la peau. En outre, BOECs permettent également pour la génération des CSPi qui sont exempts d'anomalies du caryotype, ce qui est une caractéristique essentielle de toute technologie qui sera adapté pour les applications de translation. La capacité de générer iPSCs partir d'un échantillon de sang du patient unLSO élimine la nécessité d'une biopsie de la peau et la génération de fibroblastes de la peau, facilitant ainsi la génération de cellules de patients atteints de troubles cicatrisation ou les très jeunes enfants.

Le protocole détaillé ci-dessous, approuvé par et menées en conformité avec les directives du Comité Service d'éthique national de recherches (Est de l'Angleterre), fournit une méthode simple et fiable pour la génération de BOECs avec plus de 90% d'efficacité à partir d'un volume relativement faible (60 ml) de sang périphérique. Ces cellules sont hautement prolifératifs et peuvent être soumises à des passages à plusieurs reprises, ce qui permet la production de centaines de millions de cellules à partir d'un seul échantillon de sang.

Protocol

Un schéma du protocole BOEC de production est représenté sur la Figure 1. 1. prélèvement sanguin et gradient de densité centrifugation Pour chaque donneur, ajouter 3 ml de citrate de sodium pour chacun des deux tubes de 50 ml à centrifuger coniques. Recueillir 60 ml de sang par ponction veineuse et ajouter 30 ml dans chaque tube. Retourner doucement 2-3 fois pour mélanger. Utilisez aussi peu que 40 ml de sang dans le protocole, avec des volumes de citrate ajusté en conséquence. NOTE: Il est essentiel que les échantillons de sang sont traitées dans un délai de 2 heures de la collecte. Traitement des résultats sanguins retardé une réduction marquée du rendement de la colonie excroissance. Préparer de nouveaux tubes coniques contenant un milieu de centrifugation en gradient de densité selon la première inversion de la bouteille plusieurs fois pour mélanger. Dans une hotte stérile, ajouter 15 ml de milieu de centrifugation en gradient de densité de 50 ml par tube conique (1 tube pour 10 ml de sang, 6 tubes par donneur). Diluer sang 1: 1 avec le phosphate de Dulbecco-Buffered Saline (DPBS). Incliner le tube contenant le milieu de centrifugation à gradient de densité à un angle de 20 ° avec la surface de travail. Utilisation d'une aide de la pipette et une pipette de 25 ml sérologique, la couche lentement 21 ml de sang dilué sur le dessus de la moyenne en ajoutant progressivement le sang en bas de la paroi du tube incliné. REMARQUE: Faire ainsi minimiser le mélange du sang avec la couche de gradient de densité et produira un buffy coat serré, ainsi que l'amélioration des rendements. Centrifuger les échantillons à 400 xg pendant 35 min à température ambiante avec l'accélérateur et le frein hors tension. Au cours de cette période de centrifugation, commencer le revêtement de collagène décrit dans les étapes 2.1 – 2.4. Assurer que ces mesures ont été réalisées avant de procéder à l'étape 3.1. 2. Collagène Revêtement de T-75 Flacon et préparation de milieu de culture REMARQUE: Effectuer les étapes suivantes dans une hotte de culture cellulaire. Préparer une solution de collagène / ml de 50 pg par dilution de stock TyPE collagène dans 10 ml de 0,02 M d'acide acétique. Exemple: pour le collagène mère à une concentration de 4,05 mg / ml, ajouter 123,5 pi de collagène à 10 ml d'acide acétique 0,02 M. Filtre stérile collagène suspension avant de l'utiliser. En utilisant une pipette sérologique, ajouter 7,5 ml de solution de collagène à une culture de cellules flacon T-75. Ce volume donne 5 ug de collagène / cm 2 (ou 375 ug / flacon). Flacon de Coat pendant 1 heure à température ambiante. Préparation du milieu de croissance utilisé pour la production endothéliale BOEC en la complétant basal endothelial moyen avec des suppléments de facteurs de croissance fournies par le fabricant. Ajouter tous les suppléments, mais ne pas ajouter de sérum. Pour préparer 15 ml de milieu de production BOEC, ajouter 2,5 ml de sérum de veau fœtal défini (FBS) à 12,5 ml de milieu de croissance de l'endothélium contenant les suppléments de facteurs de croissance. Suivez les étapes décrites dans la section 3. Après la période de revêtement de 1 h, aspirer la solution de collagène et laver l'acide acétique résiduel par pipetagedans 10 ml de DPBS. Aspirer le DPBS et répétez cette étape de lavage une fois de plus. Si la suspension cellulaire obtenue lors de l'étape 3.3 est prêt pour le placage pas à l'heure actuelle, ajouter 5 ml de milieu de production BOEC dans le flacon pour maintenir le revêtement de collagène de dessèchement. 3. Collecte et Placage de PBMNCs Suite à la centrifugation à gradient de densité indiqué à l'étape 1.4, recueillir soigneusement la couche leuco-plaquettaire en utilisant un transfert en plastique pipette stérile. Collection de la couche leucocyto-plaquettaire devrait donner environ 20 ml de suspension de cellules et de plasma à partir de chaque tube. Éviter de transférer le milieu de gradient de densité. Diluer la suspension cellules mononucléées 1: 1 dans du DPBS et mélanger par inversion. Centrifuger à température ambiante pendant 20 min à 300 g avec le frein et l'accélérateur au maximum. Après la centrifugation, aspirer les cellules du surnageant et remettre en ajoutant 1 ml de milieu de production BOEC de chaque pastille et à plusieurs reprises pipetage de haut en bas. Cellule de la piscine une suspensionsd appoint volume total à 10 ml avec le milieu restant. Pour obtenir une estimation du nombre total de cellules, échantillon de 10 pi de suspension cellulaire et diluer 50x avec 490 pi de la solution de Turk, qui lyser les globules rouges. Compter un échantillon de 10 ul de la suspension cellulaire diluée en utilisant un hémocytomètre. REMARQUE: 60mL de sang devrait produire environ 100-150 x 10 6 globules blancs pour le placage. Plaque de cellule entière suspension en un seul, le collagène revêtues flacon T-75, complémentaire du volume moyen de 15 ml / flacon et de la culture à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2. Cellules étalées à cette époque représentent passage 0. NOTE: Il est possible de geler les PBMNCs isolés avant l'isolement BOEC afin d'en tirer les BOECs à une date ultérieure ou afin de transporter les PBMNCs à un laboratoire différent où les BOECs peuvent être générés. Cependant, il est important de noter que le gel PBMNCs pourraient réduire l'efficacité de l'isolement BOEC. See section 8 ci-dessous pour la méthode. 4. à long terme de culture cellulaire Changer milieu tous les 2 jours par l'addition de 15 ml de milieu de production BOEC frais (5: 1 mélange de milieu de croissance des cellules endotheliales et défini FBS). Pour le week-end, les modifications moyennes peuvent être retardés à tous les 3 jours. REMARQUE: colonies excroissance devraient apparaître entre 7 et 14 jours de culture. Surveiller le flacon de culture BOEC les jours 7-14 pour l'apparition de colonies excroissance. Identifier les colonies comme des groupes circulaires de cellules présentant un pavé endothéliale morphologie classique. Une fois qu'une colonie ou plusieurs colonies sont identifiées dans le flacon, continuer avec changements de milieu et permettent colonies se développer à environ 1000 à 2000 cellules par colonie avant repiquage. Déterminer le nombre de cellules par colonie par une estimation visuelle approximative. NOTE: Comme un guide, il est habituel de passage colonies excroissance initiales Une semaine après l'identification de la première colonie de l'excroissance. <li> Les cellules Passage par le rinçage des flacons à deux reprises avec 10 ml de DPBS. Ajouter 5 ml de trypsine-EDTA 1X et incuber dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 min. Après 5 min, neutraliser la trypsine avec 10 ml de milieu (contenant FBS) et mettre en suspension les cellules avec un pipetage répété. Centrifugeuse suspension à 300 g pendant 5 min, remettre en suspension dans 15 ml de milieu frais de génération BOEC et plaque entière suspension de cellules dans un nouveau flacon T-75 (représentant passage 1, P1). Aucun revêtement de collagène est nécessaire. Continuer changements milieu tel que décrit ci-dessus jusqu'à ce que les cellules sont confluentes (environ 3-5 x 10 6 cellules par flacon). Une fois confluentes, les cellules de passage comme décrit dans l'étape 4.3. NOTE: De passage 2 et suivantes, les cellules ne nécessitent plus BOEC moyen de génération et peut être cultivé dans un milieu de croissance des cellules endothéliales et 10% la norme de FBS inactivé à la chaleur. Revêtement de collagène peut être utilisé comme une étape facultative aller de l'avant, comme il existe des preuves pour suggérer que la présence de collagène peut améliorer prolifer BOECtaux d'ation. Pour passages continue, plaque pas moins de 750 000 cellules par flacon T-75 que de faibles densités cellulaires peuvent causer les BOECs pour arrêter la prolifération. 5. congélation et décongélation Cultures BOEC Trypsiniser cellules telles que décrites à la section 4.3 et centrifuger à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 10 ml de milieu. Cela ne nécessite pas un milieu de croissance des cellules endotheliales; DMEM avec 10% de FBS standards sera suffisant. Prélever un échantillon de 10 ul de la suspension de cellules pour effectuer un comptage manuel des cellules en utilisant un hémocytomètre. Centrifuger de nouveau et remettre en suspension à 2×10 6 cellules / ml dans un milieu de cryoconservation glacé (DMEM 40% FBS à 50% et 10% de DMSO). Ajouter 0,5 ml (10 6 cellules) dans chaque flacon, Placer les flacons dans un isopropanol froid navire et le lieu de cryoconservation de la glace dans un congélateur à -80 ° C pendant au moins 2 heures avant le transfert à l'azote liquide. Ne laissez pas les cellules à -80 ° C pendant plus de 24 h. </li> Pour décongeler les cellules, ajouter 10 ml de milieu préchauffé à un tube de centrifugation conique de 15 ml. Remarque: Lors de la décongélation des cellules passage 1, décongeler dans un milieu de croissance des cellules endotheliales supplémenté avec 20% de FBS défini pour les 2 premiers jours après la décongélation. Cela conduit à un isolement cellulaire plus stable à l'avenir. Éliminer les cellules de l'azote liquide et décongélation dans un bain d'eau à 37 ° avec agitation douce jusqu'à ce que seul un petit cristal de glace est laissé dans le flacon. Ajouter le contenu du flacon goutte à goutte sur le tube de centrifugeuse conique et centrifuger à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension culot cellulaire dans 10 ml EGM-2MV + 10% de FBS. Ajouter à T-75 flacon et remplir moyenne à 15 ml. 6. Caractérisation des BOECs par cytométrie en flux Une fois que les colonies BOEC décrits à la section 4 ont été autorisés à se développer, Trypsiniser cellules telles que décrites à la section 4.4 et remettre en suspension à une concentration de 10 6 cellules par ml dans un tampon de coloration (DPBS esprith 2% de FBS et 2 mM d'EDTA). Combinez 10 5 cellules avec des anticorps conjugués au fluorochrome dirigés contre CD45, CD14, CD34, CD31 (utilisation tout à la dilution 1:20) ou VEGFR2 (dilution 1:10) (voir le tableau 1 pour plus de détails). Incuber pendant 30 min à 4 ° C dans l'obscurité. Laver les cellules avec 1 ml coloration tampon et centrifuger à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 400 pi de tampon de coloration pour l'analyse. Gardez les cellules à 4 ° C et protégé de la lumière avant l'analyse. Effectuer l'analyse cytométrique sur un cytomètre équipé pour détecter les anticorps conjugués utilisés par fluorescence dans l'essai. Utiliser un échantillon non coloré BOEC pour identifier la population de cellules sur le cytomètre en ajustant vers l'avant et des tensions de dispersion latérale, ainsi que les tensions pour les canaux de FITC et de l'APC. Déterminer gating seuils utilisant des cellules d'isotype teinté pour chaque fluorochrome. Évaluer la positivité pour chaque marqueur de surface cellulaire sur la base de la presence d'un décalage du pic d'intensité de fluorescence par rapport au témoin isotypique pour le fluorochrome en cours d'analyse. 7. Caractérisation de microscopie immunofluorescente par BOECs BOECs de plaque dans une 24 puits, à fond plat plaque de culture de tissu sans lamelles à une densité de 5 x 10 4 cellules dans 500 pi de milieu de croissance des cellules endothéliales + 10% inactivé par la chaleur FBS par puits et laisser adhérer et de grandir à 37 ° C, 5% de CO2 jusqu'à ce que les cellules couvrir au moins 70 à 80% de la surface de chaque puits (estimation de confluence par examen visuel sous un microsope lumière). Laver les cellules dans chaque puits pendant 5 minutes avec 1 ml de DPBS. Fixer les cellules O / N à 4 ° C avec 500 ul d'une solution de paraformaldehyde à 4% dans du DPBS. Laver les cellules de 3 x 5 min avec 1 ml de DPBS par puits. Ajouter et supprimer les DPBS aide d'une pipette et un aspirateur, respectivement. Perméabiliser les cellules pour 3 x 10 min avec 0,2% de polysorbate 20 dans du DPBS. </li> Incuber les cellules pendant 1 heure à température ambiante dans du tampon de blocage contenant 10% de FBS dans du DPBS. Des cellules de taches à 4 ° CO / N dans 300 ul de tampon de dilution d'anticorps (0,1% d'albumine de sérum bovin dans du DPBS) contenant des anticorps primaires dirigés contre CD34 (10 ng / ml), CD144 (1: 300) ou du vWF (1: 250) . Voir le tableau 1 pour plus de détails. Laver les anticorps primaires non liés pour 5 x 10 min avec du DPBS. Incuber les cellules pendant 1 heure à température ambiante avec l'anticorps secondaire marqué par fluorescence approprié, tel que détaillé dans le tableau 1 (tous à 1: 200). Laver anticorps secondaire non lié pour 5 x 10 min avec DPBS. Incuber les cellules avec 1 ug / ml de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans du DPBS pendant 10 minutes à température ambiante. Laver les cellules avec DPBS pour un autre 3 x 5 min. Cellules image au grossissement de 100x en utilisant un microscope inversé équipé d'une source de lumière externe pour l'excitation de fluorescence, et de capturer des images en utilisant un rattachementappareil photo numérique ED pour la suite déconnecté d'analyse. 8. gel et de dégel PBMNCs A l'issue de l'étape 3.2, après centrifugation, aspirer le milieu et manuellement perturber le culot cellulaire avec pipetage de haut en bas répété en utilisant une pointe de pipette P1000. Ajouter 1 ml de milieu de congélation, 90% de sérum et 10% de DMSO, en veillant à mélanger délicatement pour obtenir une suspension de cellules. Transférer la suspension cellulaire à un cryovial et gel et de dégel, comme décrit dans la section 5.

Representative Results

Isolement des cellules leucocytaires manteau mononucléaires provenant de 60 ml de sang donne généralement 100-150×10 6 globules blancs totaux. Lorsque plaqué dans un seul flacon T-75, le grand nombre de cellules dans la suspension de cellules non lysé, il est difficile de résoudre les cellules adhérentes individuels en utilisant la microscopie en fond clair. Changements de milieu répétées entraînent la clairance des cellules non adhérentes et permettent la visualisation de la population monocytaire adhérent de "début" EPC. Au jour 7, le T-75 contiendra environ 7×10 6 de ces cellules adhérentes allongées. De 7 à 14 jours, des colonies de BOECs devraient apparaître dans le flacon (figure 2A). Colonies apparaissent d'abord comme de 3 à 5 cellules adjacentes. Nombre de colonies excroissance peut varier de 1 à 10 colonies par 60 ml de sang. Généralement, les donateurs les plus jeunes (c.-à-vieille 20-25 ans) ont tendance à produire un plus grand nombre de colonies excroissance, qui apparaissent également plus tôt dans la culture.BOECs prolifèrent central de ce groupe de cellules à former des colonies circulaires constitués de plusieurs centaines de cellules. Les cellules dans ces colonies présentent une morphologie classique pavé endothéliale. Il est préférable de passage colonies initiales quand ils contiennent environ 1000 cellules par colonie. Colonies excroissance typiquement atteindre cette taille 7 jours après leur aspect d'origine dans la culture. Une fois que les colonies sont soumises à des passages d'origine dans un nouveau flacon T-75, il convient de proliférer pour former une monocouche confluente (3-5×10 6 cellules par flacon) dans les 5 jours ou moins (Figure 2B). Dans un petit pourcentage des isolements (<10%), les colonies excroissance ne parviennent pas à apparaître, ou ne prolifèrent pas suffisamment après cette étape de repiquage initial. BOECs qui présentent une faible prolifération après leur première passages vont rarement à devenir isolements BOEC stables et souvent arrêter la prolifération dans les deux à trois passages. Le monocytiquedébut EPC contenus dans les cultures BOEC sont non-prolifération et sont généralement éliminées des cultures au sein de 1-2 passages. Dégagement de ces cellules au début est due à la mort cellulaire, l'échec des premières cellules de ré-adhérer après repiquage et la dilution des premiers EPC non-prolifération avec des passages répétés. Passage cellules 1 peuvent être soit des passages en outre en culture ou congelées pour une utilisation ultérieure. Une fois une isolation stable est généré, les cellules peuvent être soumises à des passages à une vitesse de 1 confluentes ballon jusqu'à 3-5 nouveaux flacons T-75 jusqu'au passage 8 ou 9, avant de devenir repos. Encore une fois, la densité cellulaire est essentiel dans toute culture. Dans notre expérience, pas moins de 750 000 cellules devraient être étalées dans un flacon T-75, que les densités cellulaires plus faibles peuvent provoquer un arrêt de la croissance. Malgré le fort potentiel de prolifération de BOECs, les cellules devraient également pas être autorisés à devenir overconfluent (ie.,> 5×10 6 cellules par flacon), car cela peut causer des convers ion de BOECs à un phénotype non proliférative. Nous proposons que toute cellule étant étiqueté comme un BOEC devrait afficher surface cellulaire appropriée et coloration intracellulaire de marqueurs endothéliaux. Caractérisation des BOECs peut être réalisée par cytométrie de flux (Figure 3) ou la microscopie à fluorescence (Figure 4), après coloration pour des marqueurs de cellules endotheliales typiques. BOECs sont positifs pour les marqueurs de surface CD31 endothéliale et VEGFR2 et sont négatifs pour le marqueur CD14 de monocytes et de la pan-leucocytaire marqueur CD45. BOECs possédons aussi des corps de Weibel-Palade et ainsi exprimer facteur Von Willebrand (FvW) que discrète, ponctuée coloration cytoplasmique. Contrairement à d'autres types de cellules endothéliales matures, tels que l'artère pulmonaire ou cellules endotheliales aortiques, BOECs progénitrices expriment également le marqueur CD34 activation et sur leur surface. ftp_upload / 53384 / 53384fig1.jpg "/> Figure 1. Représentation schématique du protocole BOEC génération. Des cellules mononucléaires du sang périphérique sont isolées à partir de sang veineux par centrifugation en gradient de densité et on les cultive sur des plaques revêtues de collagène dans un milieu de croissance de l'endothélium définis additionnés de FBS. BOEC colonies apparaissent dans les 7-14 jours de culture. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2. images fond clair de cultures BOEC représentatifs. (A) colonies excroissance apparaissent dans les cultures entre les jours 7 et 14. colonies présentes comme des collections de cellules endothéliales-like, qui sont disposés dans une monocouche pavée et prolifèrent radialement à partir d'un point central. Entourant les colonies excroissance sont les mono adhérentecytic cellules qui constituent la grande majorité des cellules dans les cultures précoces. Ces cellules, précédemment décrites comme «précoce» des cellules progénitrices endothéliales, ont une morphologie de broche-like et expriment le marqueur CD14 monocytaire. (B) Après des passages, les BOECs hautement prolifératives prendre sur les cultures, que les cellules monocytes non-prolifération soit meurent ou ne parviennent pas à ré-attacher après repiquage. Barre d'échelle 250 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. Caractérisation de BOECs par cytométrie de flux. BOECs ont été trypsinisées et colorées avec des anticorps d'isotype de contrôle par fluorescence conjugués (pic rempli gris) ou des anticorps dirigés contre des marqueurs de surface spécifiques (ligne rouge). Marqueurs de surface pour la caractérisation cytométrieInclure les marqueurs hématopoïétiques CD45 et CD14, les marqueurs endothéliaux CD31 et VEGFR2 et l'progentior et marqueur d'activation endothéliale CD34. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4. La coloration par immunofluorescence de BOECs pour les marqueurs des cellules endothéliales. Des images d'immunofluorescence représentatifs de BOECs immunocolorée avec des anticorps dirigés contre le marqueur de surface des cellules endothéliales CD144 (VE-cadhérine, en haut à droite) et la glycoprotéine de sang facteur de von Willebrand (FvW, panneau en bas à droite) . Panneaux correspondants montrant la coloration DAPI nucléaire sont indiqués à gauche. Barre d'échelle 50 microns. pour CD144. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grandeversion de ce chiffre.

Discussion

We present a detailed protocol that allows for the robust and efficient derivation of BOECs from adult peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs). Our protocol includes two important refinements that represent advances on previous methods of BOEC isolation.^14-16 These include the absence of heparin in the initial PBMNC culture medium and the use of defined, embryonic stem cell-qualified serum. This latter refinement is of particular importance. Embryonic stem cell (ESC)-qualified serum is a more consistent grade of serum and, although it is not known yet what component(s) are enriched in the serum that benefit BOEC isolation, the impact of this defined serum on the efficiency of BOEC generation is clear in our hands. In addition, we have also had success in isolating BOECs using human serum, thereby allowing for the generation of BOECs for clinical translation. In our hands, this refined protocol results in the successful isolation of stable BOEC cultures from greater than 90% of donors, making it one of the most reliable BOEC generation methods reported thus far. Although the use of particular sera is critical to BOEC generation, it also represents a primary limitation of the current protocol. Future improvements to the technique could include the generation of these cells in serum-free, defined culture conditions.

Critical Steps in the protocol include processing blood samples as soon as possible after collection, complete harvesting of the buffy coat cells after density gradient centrifugation and the timely passaging of initial colonies from P0 to P1. This passaging step is critical to establishment of a stable isolation. Like other endothelial cells, BOECs appear to be very sensitive to plating density. If the plating density after passaging is too low, the BOECs will not proliferate. Conversely, if the colonies are allowed to become overconfluent before passaging, the cells will also cease to proliferate and have the tendency to convert into an elongated, mesenchymal cell phenotype. If few colonies appear from days 7 to 14, or if the colonies are small in size, troubleshooting can include increasing cell density by passaging P0 colonies into a T-25 flask instead of a T-75.

Once the technique is mastered, the resultant BOECs can be used in several applications, including in vitro studies of endothelial cell biology, disease modeling and drug screening, as well as in vivo cell transplantation therapies. An important consideration for the development of any cell therapy process is to use cells that are free from pathogenic mutations. We have previously shown that BOECs isolated using our protocol possess genomes that are free from copy number variations and are thus representative of the individual from which they were collected. In addition, we have also demonstrated that the majority of BOEC-derived iPSC lines are free from copy number variations.¹³ This contrasts with previous reports of copy number variation in fibroblast-derived iPSCs. To date, these cells remain the only iPSCs for which this degree of genomic fidelity has been reported. This feature is important for the field of iPSC biology and the use of iPSCs in disease modeling, drug screening and future cell transplantation therapies.

Materials

For blood collection
60 mL syringe with luer-lok tip	BD	309653
19G Surflo Winged Infusion Set	Terumo	SV-19BL
50 mL conical centrifuge tube	StarLab	E1450	2 per donor
Sodium Citrate	Martindale Pharmaceuticals	270541
Name	Company	Catalog Number	Comments
For buffy coat isolation
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+)	Sigma-Aldrich	D8537
Sterile wrapped plastic transfer pipettes	Appleton Woods	KC231
Turk’s Solution	Millipore	1.093E+09
Name	Company	Catalog Number	Comments
For cell culture, passaging and freezing cells
Type 1 Collagen (derived from rat tail)	BD Biosciences	35-4236
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+)	Sigma-Aldrich	D8537
0.02M Acetic Acid	Sigma-Aldrich	A6283	prepared in reagent grade water
Endothelial Growth Medium-2MV (containing Bullet Kit, but not serum)	Lonza	CC-3202	Note: It is essential that the medium does not contain heparin.   Do not use EGM-2.
Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined	Hyclone	SH30070
10x Trypsin EDTA	Gibco	T4174	Dilute to 1x in PBS prior to use
Heat Inactivated FBS	Gibco	10500-064
DMEM	Gibco	41965-039
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container	Sigma-Aldrich	C1562
Name	Company	Catalog Number	Comments
For flow cytometric characterization
FITC-conjugated mouse anti-human CD14	BD Biosciences	555397	Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD31	BD Biosciences	555445	Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human CD34	BD Biosciences	555824	Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34 Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD45	BD Biosciences	560976	Mouse IgG1k, Clone: HI30 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2	R&D Systems	FAB357A	Mouse IgG1, Clone: 89106 Dilution: 1:10
FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control	BD Biosciences	555748	Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control	BD Biosciences	555751	Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control	R&D Systems	IC002A Dilution: 1:10	Clone: 11711
EDTA, 0.5M solution	Sigma-Aldrich	E7889
Name	Company	Catalog Number	Comments
For immunofluorescent microscopy
Corning Costar 24-well tissue culture plate	Sigma-Aldrich	CLS3527
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Polysorbate 20	Sigma-Aldrich	P2287
Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody	R&D Systems	MAB72271	Clone 756510, IgG1, use at 10 μg/ml
Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144)	R&D Systems	AF938	Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300
Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF)	Abcam	ab154193	Clone EPSISR15, use at 1:250
Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-21202	Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200
Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11055	Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate	Life Technologies	A-10042	Polyclonal,  2 mg/ml, 1:200
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542	use at 1 μg/ml