Veloce enzimatica Trattamento di proteine per MS rilevamento con un microreattore flusso-through
Summary
A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.
Abstract
La grande maggioranza di spettrometria di massa (MS) a base di metodi di analisi di proteine implicano un'attività digestione enzimatica prima della rivelazione, tipicamente con tripsina. Questo passo è necessario per la generazione di piccoli peptidi peso molecolare, generalmente con MW <3000-4000 Da, che rientra nell'intervallo di scansione effettiva della strumentazione di spettrometria di massa. protocolli convenzionali coinvolgono O / N digestione enzimatica a 37 ° C. I recenti progressi hanno portato allo sviluppo di una varietà di strategie, tipicamente coinvolge l'uso di un microreattore con enzimi immobilizzati o di una serie di processi fisici complementari che riducono il tempo necessario per proteolitica digestione per alcuni minuti (per esempio, microonde o ad alta pressione). In questo lavoro, si descrive un approccio semplice e conveniente che può essere implementato in qualsiasi laboratorio per la realizzazione rapida digestione enzimatica di una proteina. La proteina (o miscela di proteine) è adsorbito sulla alta perf C18-bonded fase inversaormance particelle di silice cromatografia liquida (HPLC) precaricate in una colonna capillare, e tripsina in tampone acquoso viene infusa in particelle per un breve periodo di tempo. Per attivare il rilevamento on-line MS, i peptidi triptici vengono eluite con un sistema solvente con maggiore contenuto organico direttamente nella sorgente MS ioni. Questo approccio consente di evitare l'uso di particelle ad alto prezzo degli enzimi immobilizzati e non richiede alcun aiuto per il completamento del processo. Protein digestione e l'analisi del campione completo può essere realizzato in meno di ~ 3 min e ~ 30 minuti, rispettivamente.
Introduction
L'identificazione e la caratterizzazione di proteine purificate si ottiene spesso utilizzando tecniche MS. La proteina viene digerito con un enzima e dei suoi peptidi sono ulteriormente analizzato da MS utilizzando un semplice apparato sperimentale infusione. digestione proteolitica è necessaria per la generazione di piccoli frammenti peptidici che rientrano nel range di massa utile della maggior parte degli analizzatori MS, e che può essere facilmente frammentato attraverso bassa energia di collisione di dissociazione indotta per generare aminoacido informazioni sulla sequenza. Per proteine isolate o semplici miscele proteiche, non vi è alcuna ulteriore necessità di separazione cromatografica dei peptidi prima della rivelazione MS. Una miscela di 25-50 peptidi può essere facilmente analizzato infondendo il campione con una pompa a siringa direttamente nella sorgente MS ioni.
Lo spettrometro di massa può eseguire l'analisi e confermare la sequenza di una proteina in un breve lasso di tempo. Con i moderni metodi di acquisizione dati, questo processo può essere realizzato well'ambito pochi minuti o addirittura secondi. Il fattore limitante nel completare l'intero processo in un breve lasso di tempo è la fase di digestione proteolitica. In genere, questa viene eseguita nell'arco di alcune ore (o O / N), in soluzione, a 37 ° C, con substrato: rapporti di enzimi di (50-100): 1. Per ridurre il tempo di digestione enzimatica a minuti o secondi, microreattori enzima immobilizzato, in forma di reattori microfluidici o cartucce disponibili in commercio, sono stati descritti. 1-6 Tipicamente, l'enzima è immobilizzato da covalente, non covalente / adsorbimento fisico, complesso formazione o incapsulamento, 3,6 la maggiore efficienza del processo enzimatico viene abilitato dalla grande superficie-volume e rapporti enzima-to-substrato. Ulteriori vantaggi di reattori immobilizzate comprendono la riduzione autolisi e interferenze da parte dell'enzima in analisi MS, una migliore stabilità enzimatica e riutilizzabilità. Una varietà di approcci, utilizzando il vetro o dispositivi microfabbricate polimerici sono stati descritti,utilizzando enzimi immobilizzati su sfere magnetiche da interazioni antigene-anticorpo, 7,8 intrappolati nelle reti di nanoparticelle d'oro, 9 incapsulato in titanio-allumina sol-gel 10 e nanozeolites, 11 o catturati attraverso Ni-NTA o His-Tag formazione del complesso. In alternativa 6 , sono stati sviluppati capillari aperti tubolari con enzimi immobilizzati, pure. 12 Inoltre, maggiore segmentazione proteolitica è stata dimostrata utilizzando controllata irradiazione a microonde 13 o tecnologia cicli di pressione assistita o pressione (PCT) per ridurre i tempi di reazione a 30-120 min. 14
Nonostante i molteplici vantaggi dei reattori enzima immobilizzato, i costi delle cartucce commerciali è alto, la disponibilità di dispositivi microfluidici per uso di routine è limitato, e l'uso di tecnologie microonde o PCT risultati in necessità di strumentazione aggiuntiva. L'obiettivo di questo lavoro è stato quello di sviluppare un metodo che circumveNTS questi svantaggi, e che può essere facilmente implementato in ogni laboratorio per potenziare ricercatori un approccio semplice ed efficace per l'esecuzione di scissione enzimatica di proteine in preparazione per l'analisi MS in pochi minuti. Questo approccio si basa sull'uso di idrofobici, C18-particelle che sono pre-caricate in un capillare o dispositivo microfluidica, e l'adsorbimento della proteina (s) di interesse nelle particelle seguita da digestione enzimatica durante l'infusione dell'enzima sul letto impaccato e proteine catturato (s). In questo approccio, il substrato viene immobilizzato attraverso interazioni non covalenti, e l'enzima è infuso proteina immobilizzata. L'efficienza proteolitica digestione viene aumentata dalle grandi superfici di particelle che espongono la proteina per la trasformazione enzimatica, distanze e tempi di diffusione da e verso la superficie delle particelle ridotta, migliorato trasferimento di massa, nessun legame covalente che possono influenzare l'attività dell'enzima, capacità rapidamente evaluate combinazioni di diversi enzimi, disponibilità, e multiplexing se il processo viene eseguito in un formato microfluidica. Questo approccio è dimostrato con l'uso di una miscela di proteine standard e tripsina-enzima più comunemente usato per la digestione proteolitica prima della rilevazione ESI-MS. Lo spettrometro di massa utilizzato per la rilevazione in questo studio era uno strumento lineare trappola quadrupolo (LTQ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il microreattore descritto in questo lavoro fornisce un facile da implementare apparato sperimentale per mineralizzazione enzimatica delle proteine per permettere l'analisi MS e identificazione in meno di 30 min. I vantaggi di questo sistema, rispetto agli approcci convenzionali, comprendono semplicità, velocità, basso consumo di reagenti e bassi costi. In particolare, non vi è alcuna necessità di costosi perline tripsina immobilizzati e cartucce. La preparazione del microreattore capillare è semplice <st…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.
Materials
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1000 µL) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µL) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µL) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µL) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µL syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015“ ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 mL) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 mL) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 mL) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 mL) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 mL) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µL) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µL) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Reagents | |||
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
Referencias
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