Быстрое Ферментативный Обработка белков для обнаружения MS с проточный микрореакторе
Summary
A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.
Abstract
Подавляющее большинство масс-спектрометрии (МС) основе методов анализа белка включают стадию переваривания ферментативная до обнаружения, как правило, с помощью трипсина. Этот шаг необходим для генерации малых пептидов молекулярной массой, как правило, с MW <3000-4000 Da, которые находятся в пределах эффективного диапазона сканирования масс-спектрометрии приборов. Обычные протоколы включают O / N ферментативного расщепления при 37 ° С. Последние достижения привели к разработке различных стратегий, как правило , связанных с использованием микрореакторе с иммобилизованными ферментами или целого ряда дополнительных физических процессов , которые уменьшают время , необходимое для протеолитического расщепления в течение нескольких минут (например, микроволновая печь или высоко- давление). В этой работе мы опишем простой и экономически эффективный подход, который может быть реализован в любой лаборатории для достижения быстрого ферментативного расщепления белка. Белок (или протеиновую смесь) адсорбируют на С18-скрепленные с обращенной фазой высокой перфорацияormance жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) частицы диоксида кремния, предварительно загруженные в капиллярной колонкой, и трипсина в водном буфере вливают над частицами в течение короткого периода времени. Чтобы включить он-лайн обнаружения MS, Триптические пептиды элюируют системой растворителей, с повышенным содержанием органических веществ непосредственно в источнике ионов МС. Такой подход позволяет избежать использования частиц дорогостоящих иммобилизованного фермента и не требует какой-либо помощи для завершения процесса. Переваривания белков и полный анализ образца может быть достигнуто менее чем за ~ 3 мин и ~ 30 мин, соответственно.
Introduction
Идентификация и характеристика очищенных белков часто достигается за счет использования методов масс-спектрометрии. Белок переваривается с ферментом и его пептиды дополнительно анализируются с помощью МС с помощью простого инфузионную экспериментальной установки. Протеолитическим расщеплением необходимо для генерации небольших пептидных фрагментов, которые попадают в полезном диапазоне масс большинства анализаторов MS, и которые могут быть легко фрагментированы с помощью низкой энергии соударения индуцированной диссоциации для генерирования информации о последовательности аминокислот. Для получения изолированных белков или простых смесей белков, нет необходимости в дальнейшем хроматографического разделения пептидов до обнаружения MS. Смесь 25-50 пептидов могут быть легко проанализированы путем инфузии образца с помощью шприца непосредственно в источнике ионов МС.
Масс-спектрометр может провести анализ и подтвердить последовательность белка в течение короткого периода времени. С помощью современных методов сбора данных, этот процесс может быть достигнуто шithin несколько минут или даже секунд. Сдерживающим фактором в завершении всего процесса на коротком временном масштабе является протеолитический стадия пищеварения. Как правило, это осуществляется в течение нескольких часов (или O / N) в растворе, при 37 ° С, с использованием субстрата: ферментные соотношения (50-100): 1. Для уменьшения ферментативной время пищеварения минут или секунд, иммобилизованных микрореакторы фермента, в виде микрофлюидальных реакторов или коммерчески доступные картриджи, которые были описаны. 1-6 Как правило, фермент иммобилизован ковалентным, нековалентная / физической адсорбции, комплекс формирование или инкапсуляция, 3,6 повышенная эффективность процесса ферментативного быть включен по большой поверхности к объему и соотношения фермент-к-подложке. Дополнительные преимущества иммобилизованных реакторов включают снижение автолиза и помех от фермента в анализе MS, улучшенную стабильность фермента и возможность многократного использования. Разнообразие подходов, с использованием стекла или полимерных микроизготовленном устройств были описаны,с использованием ферментов , иммобилизованных на магнитных шариков с помощью антиген-антитело взаимодействий, 7,8 захваченный в золотых наночастиц сетей, 9 воплощен в оксид титана-оксид алюминия золь-гелей 10 и nanozeolites, 11 или захвачены в плен через Ni-NTA или Его-Таг формирования комплекса. 6 В качестве альтернативы , открытой трубчатые капилляры с иммобилизованными ферментами были разработаны, а также. 12 Кроме того, повышенная протеолитическое расщепление было продемонстрировано с помощью контролируемого микроволнового излучения 13 или давления , при содействии или под давлением технологии непрерывной цикличности (РСТ) для уменьшения времени реакции до 30-120 мин. 14
Несмотря на многочисленные преимущества иммобилизованных реакторов фермента, стоимость коммерческих картриджей высока, наличие микрофлюидальных устройств для повседневного использования ограничено, а также использование результатов микроволновые или РСТ технологии нуждаются в дополнительной аппаратуры. Цель данной работы заключалась в разработке метода, который circumveNTS эти недостатки, и которые могут быть легко реализованы в любой лаборатории, чтобы расширить возможности исследователей с простым и эффективным подходом для осуществления ферментативного расщепления белков в процессе подготовки к анализу MS в течение нескольких минут. Подход основан на использовании гидрофобных, С18-частиц, которые предварительно загружены в капилляре или микрожидком устройстве, и адсорбцию белка (ов), представляющие интерес на эти частицы с последующим ферментативным расщеплением во время инфузии фермента над уплотненный слой и захватили белок (белки). При таком подходе субстрат иммобилизованные через нековалентных взаимодействий, а фермент вливают над иммобилизованным белком. Эффективность протеолитического расщепления увеличивается на большой поверхности частиц областей, которые выставляют белок для обработки ферментативной, уменьшение расстояния и времени диффузии и из поверхности частиц, улучшается перенос массы, отсутствие ковалентное, которые могут влиять на активность фермента, способность быстро evaluatе комбинации различных ферментов, одноразовости и мультиплексированием, если процесс выполняется в микрожидком формате. Этот подход демонстрируется с использованием смеси стандартных белков и трипсин-наиболее часто используемым ферментом для протеолитического расщепления до обнаружения ESI-MS. Масс-спектрометр используется для обнаружения в данном исследовании была линейная ловушка квадрупольного (LTQ) инструмент.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микрореактор описано в данной работе, обеспечивает простую в реализации экспериментальной установки для осуществления ферментативного расщепления белков для проведения анализа MS и идентификацию менее чем за 30 мин. Явные преимущества этой системы, по сравнению с традиционными подхо?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.
Materials
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1000 µL) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µL) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µL) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µL) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µL syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015“ ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 mL) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 mL) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 mL) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 mL) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 mL) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µL) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µL) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Reagents | |||
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
Referencias
- Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , (2014).
- Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
- Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
- Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
- Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
- Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).
- Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. , 1071-1074 (2009).
- Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
- Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
- Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
- Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
- Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
- Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
- Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
- Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
- Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
- Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
- Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
- Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
- Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
- Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
- Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
- Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).
