קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים
Summary
To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.
Abstract
פילמנטיות אקטין ממלא תפקיד מכריע ברוב התהליכים בתא כוללים תנועתיות ו, בתאי מערכת חיסון, ההיווצרות של אינטראקציה תאי תאי מפתח הידועה כסינפסה החיסונית. F- אקטין גם העריך לשחק תפקיד בויסות החלוקה מולקולרית בקרום של תאים כוללים דינמיקת שלפוחית תת-קרומי ואשכולות חלבון. בעוד טכניקות מיקרוסקופ האור סטנדרטית מאפשרות תצפיות כלליות ועקיפות מוגבלים להתבצע, אירועים תאיים ומולקולריים רבים, כולל אשכולות וזרימה מולקולרית מתרחשים באוכלוסיות באורך-מאזניים הרבה מתחת לכח בפתרון של מיקרוסקופ אור הרגילה. על ידי שילוב כוללת הקרינה השתקפות הפנימית עם מיקרוסקופיה תאורת סופר ההדמיה ברזולוציה השיטה מובנה, הזרימה המולקולרית דו-ממדית של F- אקטין בסינפסה החיסונית של תאי T נרשמה. ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן קורלציה תמונה (מאפיינים אילו) ולאחר מכן יושם, אשר מייצרת resul כימותTS בצורה של היסטוגרמות מהירות ומפות וקטור המייצגות זרימת יווניות וגודל. פרוטוקול זה מתאר את השילוב של טכניקות הדמיה ומאפיינים אילו ברזולוציה הסופר לייצר תזרים וקטורים ברמות תת-עקיפה של פרט. טכניקה זו שימשה כדי לאשר זרימה אקטין שהיא סימטרי מדרדר והצנטריפטלי ברחבי הפריפריה של תאי T על היווצרות סינפסה.
Introduction
מטרת הניסוי היא תמונה ומאפיין את הזרימה המולקולרית של filamentous- אקטין (F-) בתאים חיים T, שחורגת ממגבלת העקיפה כדי להקים זרימת כיוון ועצמה במהלך סינפסה החיסונית (IS) היווצרות. טכניקה זו תבוצע באמצעות מיקרוסקופ מובנה תאורה (SIM) במצב הקרינה השתקפות פנימית (TIRF) כולל, הדמיה Jurkat תאי T יוצרים סינפסה מלאכותית על הפעלת coverslips מצופה אנטי-CD3- ונוגדנים נגד CD28. הצורות היא בין תא T והיעד שלה; תא הצגת אנטיגן (APC) על קולטן תא T 1,2 הפעלה (TCR). כמו זה הוא הצעד הראשון בקביעה האם המערכת החיסונית אדפטיבית יוצרת תגובה חיסונית לזיהום, את ההשלכות של היענות לגירויים נכונה יכולות לגרום למספר המחלות. החשיבות של האינטראקציה התא T-APC מתועדת היטב, לעומת זאת, התפקיד (ים) של הבוגר הוא לאחר סי TCR הראשוניתהפנמת gnal הם עדיין לא הבינו באופן מלא.
כחשב שלד התא כדי לסייע שני תהליכים הקשורים להפעלת TCR (התנועה של מולקולות בקרום הפלזמה והשליטה של מולקולות איתות תלויות ביקטין שלד תא 3,4), הבנה כיצד שלד התא מארגן מחדש מרחב ובזמן יבהיר את הצעדים של ארגון מחדש מולקולרי במהלך היווצרות סינפסה. הוא חשב זרימת מדרדר של F- אקטין לכלוא אשכולות TCR לכיוון מרכז סינפסה החיסונית, הוא האמין טרנסלוקציה זה להיות חיוני להפסקת אות ומחזור; סיוע לאיזון העדין של הפעלת תא T 5.
בעוד מיקרוסקופ פלואורסצנטי הסטנדרטי הוא כלי גמיש שממשיך לספק תובנה על אירועים ביולוגיים רבים, כולל אינטראקציות תא-תא, הוא מוגבל על ידי היכולת של המערכת כדי לפתור במדויק fluorophores מרובה המתגורר קרוב יותר מdiffrמגבלת פעולה (≈200 ננומטר) של אחד את השני. אירועים מולקולריים רבים בתוך תאים כרוכים אוכלוסיות צפופות של מולקולות ולהציג סידור דינמי או בקפאון או על גירוי מסוים, מיקרוסקופ אור הרגילה אינה מספקת את התמונה המלאה.
השימוש בהדמיה ברזולוציה סופר אפשר לחוקרים לעקוף את מגבלת העקיפה תוך שימוש במגוון של טכניקות. מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה בודדת (SMLM) כגון PALM ו6,7 STORM יש את היכולת לפתור את המיקום של מולקולות עד דיוק של כ -20 ננומטר, לעומת זאת, טכניקות אלה מסתמכים על פי רכישה ארוכה, בניית תמונה על מסגרות רבות . בדרך כלל זה דורש דגימות להיות קבועים או למבנים להציג ניידות נמוכה fluorophores כך בודדת לא כהלכה כמספר רב של נקודות. בעוד דלדול פליטה מאולץ (STED) הדמיה מאפשרת רזולוציה סופר דרך עירור confocal מאוד סלקטיבית 8, הסריקה הנדרשתגישה יכולה להיות איטית מעל שדות תא כל מבט. STED גם מדגים phototoxicity המשמעותי לרזולוציות גבוהות יותר כתוצאה מהעלייה בכוחה של קרן הדלדול.
מיקרוסקופיה תאורה המובנה (SIM 9) מספקת אלטרנטיבה לשיטות אלה, מסוגלים להכפיל את הרזולוציה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי והוא תואם יותר עם הדמיה תא חי מטכניקות SMLM הנוכחיות. היא משתמשת בסמכויות לייזר נמוכות, במערכת רחבה בתחום לשדות כל תא מבט; מיועד לספק מוגבר במהירויות רכישה, והוא תואם עם תיוג fluorophore סטנדרטי. הטבע רחב בתחום של SIM גם מאפשר הניצול של הקרינה הכוללת הפנימית השתקפות (TIRF) לעירור סלקטיבית, עם עומק חדירה בממד הצירי של <100 ננומטר.
ספקטרוסקופיה מתאם תמונה (ICS) היא שיטה של correlating תנודות בעוצמת הקרינה. אבולוציה של ICS; im מרחב ובזמןספקטרוסקופיה מתאם גיל (מאפיינים אילו 10) קורלציה אותות ניאון תאיים בזמן ובמרחב. באמצעות התאמת עוצמות פיקסל עם סובבי פיקסלים במסגרות מפגרת באמצעות פונקציית מתאם, מידע צבר לגבי זרימת מהירויות ויווניות. כדי להבטיח אובייקטים סטטיים לא להפריע לניתוח המאפיינים אילו, מסנן אובייקט נייח מיושם, אשר עובד על ידי הפחתת ממוצע נע של עוצמות פיקסל.
הוא האמין הטכניקה המוצגת כאן להיות ההפגנה הראשונה של ספקטרוסקופיה מתאם תמונה מיושמת לנתונים במיקרוסקופ ברזולוציה הסופר לכמת את הזרימה המולקולרית בתאים חיים 11. שיטה זו משפרת בהדמיה עקיפה המוגבל של זרימת F- אקטין באמצעות ניתוח המאפיינים אילו 12 ותתאים חוקרים שרוצים לקבוע זרימה מולקולרית דו-ממדית בתאים חיים, מנתונים שנרכשו ברזולוציות מרחבי שמעבר לגבול השתברות אור.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקה זו מאפשרת לחוקרי תמונה ולכמת בעבר פרטים פתירים בתאים לבטא הקרינה. בתוצאות שלנו מראים כי F- אקטין זורם בצורה סימטרית מהפריפריה התא לכיוון מרכז התא בתא T הוא. הממצאים אלה עולים בקנה אחד עם תוצאות קודמות מנתוני רשם גלים פרופיל קו 1D 13 ולהאריך את היכולת של ניתו?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada’s Discovery Grant program.
Materials
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
Referencias
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
- Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
- Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).
