הפקה של דומיינים בולטים norovirus אדם<em> E. coli</em> עבור רנטגן קריסטלוגרפיה
Summary
כאן, אנו מתארים שיטה להביע ולטהר norovirus באיכות גבוהה בולטות (P) תחומים ב E. coli לשימוש במחקרים קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על תחומי P calicivirus אחרים, כמו גם חלבונים הלא מבניים, כלומר., הגנום צמוד חלבונים נגיפיים (VPG), פרוטאז, ו RNA רפליקאז (RdRp).
Abstract
קפסיד norovirus מורכב חלבון מבני גדול יחיד, כינת VP1. VP1 מחולק פגז (S) תחום תחום בולט (P). תחום S מהווה פיגום רציף סביב רנ"א הנגיפי, ואילו צורות המושלמות P קוצים ויראלי על תחום S ומכיל הקבע עבור אינטראקציות antigenicity ומארח תאים. תחום P נקשר מבני פחמימות, כלומר., אנטיגנים קבוצת histo-דם, אשר נחשבים חשובים עבור זיהומי norovirus. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לייצור תחומי P norovirus באיכות גבוהה בתשואות גבוהות. חלבונים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש עבור קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן ו ELISA כדי לחקור אינטראקציות antigenicity ומארח תאים.
תחום P הוא משובט ראשית לתוך וקטור ביטוי ולאחר מכן הביע בחיידקים. החלבון הוא מטוהר באמצעות שלושה צעדים כרוכים משותקים כרומטוגרפיה זיקת מתכת-יון כרומטוגרפיה הדרת גודל. בעקרונית, אפשר לשכפל, מפורש, לטהר, ולגבש חלבונים בתוך פחות מארבעה שבועות, מה שהופך בפרוטוקול זה מערכת מהירה לניתוח זני norovirus המתהווה.
Introduction
Noroviruses אדם הם הגורם העיקרי של גסטרואנטריטיס חריפה ברחבי העולם 1. וירוסים אלה שייכים למשפחת Caliciviridae, אשר יש לפחות חמישה סוגים, כולל norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, ו Nebovirus. למרות השפעה הגבוה על מערכת הבריאות והפצה רחבה, חקר noroviruses אדם נפגע על ידי עדר מערכת תרבית תאים חזקה. נכון להיום, אין חיסונים שאושרו או אסטרטגיות אנטי זמינות.
חלבון קפסיד הגדול norovirus, כינת VP1, ניתן לחלק תחום פגז (S) ואת התחום בולט (P) 2. תחום P מחובר תחום S ידי ציר גמיש (H) באזור. תחום S מהווה פיגום סביב רנ"א הנגיפי, ואילו תחום P מהווה את החלק קצוני של קפסיד ויראלי. תחום P מרכיב לתוך הדימרים רלוונטיים מבחינה ביולוגית כאשר הביעו בחיידקים. ה- P דimer אינטראקציה עם מבני פחמימות, כינת אנטיגנים קבוצת histo-דם (HBGAs) שנמצאים כמו אנטיגנים מסיסים המצויים ברוק ומצאו בתא פונדקאי מסוים 3. האינטראקציה תחום-HBGA P נחשב חשוב זיהום 4. ואכן, לאחרונה דווח חשף את החשיבות של HBGAs הסינטטי או HBGA להביע חיידקי זיהום norovirus אנושי במבחנה 5.
מחקרים שוטפים לגבי מצורף התא המארח של noroviruses מבוצעים בעיקר עם חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) שיכול לבוא לידי ביטוי בתאי חרקים או עם תחומי P רקומביננטי לידי ביטוי Escherichia coli (E. coli). כדי להבין את יחסי הגומלין P תחום-HBGA ברזולוציה אטומית, P מבנים מורכבים תחום-HBGA ניתן לפתור באמצעות קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור ביטוי מושלם P וטיהור המאפשר ייצור של תחום P בכמות ובאיכות גבוהה לשמש crystall רנטגןography. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על תחומי P calicivirus אחרים וחלבונים הלא מבניים.
תחום P הוא קודון אופטימיזציה עבור E. ביטוי coli ו משובטים לתוך וקטור העברה סטנדרטי. תחום P הוא מחדש משובט לתוך וקטור ביטוי מקודד polyhistidine התג (שלו) לבין חלבון מחייב מנוז (MBP) כי הם ואחריו אתר מחשוף פרוטאז. חלבון ההיתוך המושלם MBP-שלו-P מתבטא E. coli, ואחריו שלושה שלבים לטיהור. חלבון ההיתוך המושלם MBP-שלו-P מטוהר באמצעות כרומטוגרפיה זיקת יון מתכת משותקת (IMAC). לאחר מכן, חלבון ההיתוך הוא בקע עם rhinovirus אדם (HRV) פרוטאז -3C ואת תחום P מופרד MBP-שלו על ידי צעד טיהור נוסף IMAC. לבסוף, תחום P הוא מטוהר באמצעות כרומטוגרפיה הדרת גודל (SEC). התחום P מטוהרים לאחר מכן ניתן להשתמש עבור קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. הקרנת התגבשות תנאי חלבון היא performed עם ערכות הקרנה זמינות מסחרי באמצעות ריכוזי חלבון שונים P מושלם. צמיחת קריסטל הוא ציין והתנאים המבטיחים ביותר ממוטבים.
עם השיטות שתוארו כאן, אפשר לעבור גן לחלבון לבנות בתוך פחות מארבעה שבועות. לכן, השיטה שלנו הביטוי המושלם P, טיהור, ההתגבשות מתאימה לחקור את אינטראקצית norovirus לארח ברמה המולקולרית ולספק נתונים חשובים כדי לסייע עַדכָּנִי חיסון הקרנת עיצוב תרופה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור הביטוי וטיהור תחומי P norovirus באיכות גבוהה ובכמות. Noroviruses אינם נלמדים היטב נתונים מבניים נדרשים ברציפות. למיטב ידיעתנו, ייצור מושלם P תוך שימוש בפרוטוקולים אחרים (למשל, תחומים P-tagged GST) כבר בעייתי, עד כה, ונתונים מבניים מספיק על האינטראקצי?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The funding for this study was provided by the CHS foundation. We acknowledge the protein crystallization platform within the excellence cluster CellNetworks of the University of Heidelberg for crystal screening and the European Synchrotron Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities.
Materials
| P domain DNA | Life Technologies | GeneArt Gene Synthesis | |
| pMalc2x vector | On request | ||
| BamHI | New England Biolabs | R0136L | |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| Econo-Column Chromatography Column | Bio-Rad | 7372512 | 2.5 cm x 10 cm, possible to use other size |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| Vivaspin 20 | GE Healthcare | various | cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
| One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Life Technologies | C6000-03 | |
| HRV 3C Protease | Merck Millipore | 71493 | |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 PG | GE Healthcare | 28-9893-34 | SEC column |
| JCSG Core suites | Qiagen | various | 4 screens with each 96 wells |
| Carbohydrates | Dextra Laboratories, UK | various | Blood group products |
Referencias
- Ahmed, S. M., et al. Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).
- Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. Three-dimensional structure of calicivirus. J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).
- Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).
- Marionneau, S., et al. Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals. Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346, 755-759 (2014).
- Hansman, G. S., et al. Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability. J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).
- Fath, S., et al. Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression. PLoS One. 6 (e17596), (2011).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Kabsch, W. Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants. J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).
- Mccoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
- Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly. J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).
- Hansman, G. S., et al. Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle. J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).
- Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. Human noroviruses’ fondness for histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).
- Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).
