ヒトノロウイルス突出ドメインの生産で<em> E。大腸菌</em> X線結晶用
Summary
ここでは、Eに（P）ドメインを突出高品質のノロウイルスを発現し、精製するための方法を記載しますX線結晶学研究における使用のための大腸菌 。この方法は、他のカリシウイルスPドメイン、ならびに非構造タンパク質に適用することができる、すなわち 、ウイルスタンパク質ゲノム結合（のVPg）、プロテアーゼ、及びRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）。
Abstract
ノロウイルスキャプシドは、単一の主要構造タンパク質で構成され、VP1と呼ばれます。 VP1は、シェル（S）ドメインと突起（P）ドメインに細分されます。 Sドメインは、PドメインのフォームSドメイン上のウイルスのスパイクのに対し、ウイルスRNAの周りに連続した足場を形成し、抗原性および宿主細胞の相互作用のための決定が含まれています。 Pドメインは、炭水化物構造、 すなわち特異的に結合する。ノロウイルス感染症のために重要であると考えられている、ヒスト血液型抗原、。このプロトコルでは、我々は、高収率で高品質のノロウイルスPドメインの製造方法を説明します。これらのタンパク質は、次いで抗原と宿主細胞の相互作用を研究するために、X線結晶構造解析およびELISAのために使用することができます。
Pドメインは、まず、発現ベクターにクローニングした後、細菌中で発現されます。タンパク質は、金属イオンアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを固定化することを含む3つのステップを使用して精製されます。に原理は、特急、クローン精製し、そしてこのプロトコル新興ノロウイルス株を分析するための迅速なシステムになり4週間未満、中のタンパク質を結晶化することが可能です。
Introduction
人間のノロウイルスは、急性胃腸炎、世界中の1の主な原因です。これらのウイルスはノロウイルス 、 サポウイルス 、Lagovirus、 ベシウイルス 、およびNebovirusを含む少なくとも5属が存在するうち、 カリシウイルス科ファミリーに属します。医療システムと広く分布に対するそれらの高い衝撃にもかかわらず、人間のノロウイルスの研究は、強固な細胞培養系の欠如によって妨げられています。現在までに、利用可能な認可されたワクチンまたは抗ウイルス戦略はありません。
ノロウイルスの主要キャプシドタンパク質、VP1と呼ばれるシェル（S）ドメインと突起（P）領域2に分割することができます。 Pドメインは、柔軟なヒンジ（H）領域によってSドメインに接続されています。 Pドメインは、ウイルスキャプシドの最も外側の部分を形成するのに対し、Sドメインは、ウイルスRNAの周りに足場を形成します。細菌で発現された場合、Pドメインは、生物学的に関連する二量体に組み立てます。 P DIMERは、糖鎖構造と相互作用し、唾液中の可溶性抗原として存在し、特定の宿主細胞3に見られるヒスト血液型抗原（HBGAs）と呼ばれます。 PドメインHBGA相互作用は、感染4のために重要であると考えられています。確かに、最近の報告では、in vitro 5 でのヒトノロウイルス感染症のための合成HBGAsまたはHBGA-発現する細菌の重要性を明らかにしました。
ノロウイルスの宿主細胞付着に関する現在の研究は、主に、昆虫細胞または大腸菌 （E. coli）中で発現される組換えPドメインと表現することができるウイルス様粒子（VLP）を用いて行われます。原子分解能でPドメインHBGA相互作用を理解するために、PドメインHBGA複雑な構造は、X線結晶学を用いて解くことができます。ここでは、高い量と質のPドメインの生産はX線クリに使用されることを可能にするPドメインの発現および精製のためのプロトコルを記述しography。また、この方法は、他のカリシウイルスのPドメインおよび非構造タンパク質に適用することができます。
Pドメインは、 大腸菌のためにコドン最適化され大腸菌発現標準トランスファーベクターにクローニングしました。 Pドメインは、その後プロテアーゼ切断部位が続くポリヒスチジン（His）をタグ及びマンノース結合タンパク質（MBP）をコードする発現ベクターに再クローニングします。 MBP-Hisを、Pドメインの融合タンパク質は、 大腸菌で発現されます大腸菌は 、3精製工程が続きます。 MBP-Hisを-Pドメイン融合タンパク質は、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（IMAC）を用いて精製されます。次に、融合タンパク質は、ヒトライノウイルス（HRV）-3℃プロテアーゼ及びPドメインが追加のIMAC精製工程によってMBP-彼から分離されて切断されます。最後に、Pドメインは、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いて精製されます。精製されたP領域は、次に、X線結晶学のために使用することができます。タンパク質結晶化条件のスクリーニングはperfoです異なるPドメインタンパク質の濃度を用いて、市販のスクリーニングキットにrmed。結晶成長が観察され、最も有望な条件が最適化されています。
ここに記載された方法で、それ未満で4週間以内に構築するタンパク質を遺伝子から移動することが可能です。したがって、Pドメインの発現、精製、および結晶化の手法は、分子レベルでノロウイルス – 宿主相互作用を研究し、最新のワクチン設計および薬物スクリーニングを支援するために重要なデータを提供するのに適しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで、我々は高品質と量におけるノロウイルスPドメインの発現および精製のためのプロトコルについて説明します。ノロウイルスは十分に研究されておらず、構造データを連続的に必要とされています。我々の知る限りでは、他のプロトコル（ 例えば 、GSTタグ付きPドメイン）を使用して、Pドメインの生産はこれまでのところ、問題となっており、ノロウイルス-ホスト相互作用に?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The funding for this study was provided by the CHS foundation. We acknowledge the protein crystallization platform within the excellence cluster CellNetworks of the University of Heidelberg for crystal screening and the European Synchrotron Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities.
Materials
| P domain DNA | Life Technologies | GeneArt Gene Synthesis | |
| pMalc2x vector | On request | ||
| BamHI | New England Biolabs | R0136L | |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| Econo-Column Chromatography Column | Bio-Rad | 7372512 | 2.5 cm x 10 cm, possible to use other size |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| Vivaspin 20 | GE Healthcare | various | cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
| One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Life Technologies | C6000-03 | |
| HRV 3C Protease | Merck Millipore | 71493 | |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 PG | GE Healthcare | 28-9893-34 | SEC column |
| JCSG Core suites | Qiagen | various | 4 screens with each 96 wells |
| Carbohydrates | Dextra Laboratories, UK | various | Blood group products |
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