Een eenvoudige bioassays voor de beoordeling van de vasculaire endotheliale groeifactoren
Summary
We beschrijven een eenvoudige celgebaseerde bioassay voor het detecteren, kwantificeren en volgen van de activiteit van leden van de vasculaire endotheliale groeifactor familie van liganden. De test maakt gebruik van chimère receptoren tot expressie gebracht in een factor-afhankelijke cellijn die een semi-kwantitatieve of kwantitatieve beoordeling van receptorbinding en verknoping verschaffen door het ligand.
Abstract
De analyse van receptor tyrosine kinases en hun interactie liganden betrokken bij vasculaire biologie is vaak moeilijk als gevolg van de constitutieve expressie van families van verwante receptoren, een groot aantal verwante liganden en de moeilijkheid van het omgaan met primaire, gespecialiseerde endotheelcellen. Hier beschrijven we een bioassay voor de detectie van liganden aan de vasculaire endotheliale groeifactor receptor-2 (VEGFR-2), een belangrijke transducer signalen die angiogenese en lymfangiogenese bevorderen. Een cDNA coderend voor een fusie van het extracellulaire (ligand bindend) regio VEGFR-2 met de transmembraan- en cytoplasmatische regio van de receptor erytropoëtine (EpoR) wordt uitgedrukt in een factor-afhankelijke cellijn Ba / F3. Deze cellijn groeit in aanwezigheid van interleukine-3 (IL-3) en het intrekken van deze factor resulteert in dood van de cellen binnen 24 uur. Expressie van het VEGFR-2 / EpoR receptor fusie een alternatief mechanisme voor overleving en potentia bevorderenlly proliferatie van stabiel getransfecteerde Ba / F3-cellen bij aanwezigheid van een ligand kan binden en verknopen van het extracellulaire deel van het fusie-eiwit (dat wil zeggen, een die kan verknopen de VEGFR-2 extracellulaire gebied). De test kan worden uitgevoerd op twee manieren: a semi-kwantitatieve benadering waarbij kleine hoeveelheden ligand en cellen maken een snel resultaat in 24 uur en een kwantitatieve benadering waarbij surrogaat markers van een levensvatbare celaantal. De test is relatief gemakkelijk uit te voeren, reageert zeer bekende VEGFR-2 liganden en geschikt extracellulaire remmers van VEGFR-2 signalering zoals monoklonale antilichamen tegen de receptor of liganden, en oplosbare ligand vallen.
Introduction
De vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) familie van uitgescheiden eiwitten groeifactoren en hun verwante celoppervlakreceptoren is een belangrijk en diverse groep van oplosbare liganden en receptoren membraan ingebedde respectievelijk althans in transduceren signalen over cellulaire membranen. Zij functioneren voornamelijk in endotheelcellen, maar ook in cellen van epitheliale oorsprong en van het immuunsysteem 1,2. Signaalroutes die door ligand geactiveerde VEGF receptoren (VEGFRs) zijn kritisch belangrijke pathologieën, zoals leeftijdsgebonden maculadegeneratie en kanker en therapeutische ze gericht zijn veelvuldig klinisch gebruik (bijvoorbeeld het monoklonale antilichaam bevacizumab dat VEGF-A target) 3,4.
Een van de complexiteit van de VEGF-familie is de diversiteit van oplosbare liganden in de natuur (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF eiwitten waarvoor de parapox virusfamilie orf en slangengif VEGF, plus andere remmendeisovormen van VEGF-A) 2.
Deze liganden interactie met drie leden van de receptor tyrosine kinase familie, namelijk VEGFR-1, VEGFR-2 en VEGFR-3. Deze receptoren zijn variabel tot expressie gebracht op verschillende celtypes evenwel vaak samen op het oppervlak van endotheelcellen die bloed- en lymfevaten in vele afmetingen 5 lijn. VEGFR-2 kan binden liganden zoogdier VEGF-A 6, VEGF-C en VEGF-7 D 8,9 en orf-virus 10 VEGF en VEGF slangengif 11. VEGFR-2 speelt een belangrijke rol bij het stimuleren angiogenese (de groei van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaande vaten) in embryonale ontwikkeling, wondgenezing, kanker en oogziekten. In deze context, liganden zoals VEGF-A, -C en -D binden en activeren van de receptor op bloed vasculaire endotheelcellen 12-15. Op lymfatische endotheelcellen, VEGFR-2 een rol speelt in lymfevaten, de vorming van nieuwe lymfevaten 16. VEGFR-2 kan ook leiden tot verwijding en de uitbreiding van de grote slagaders en lymfevaten in gezonde weefsels en de ziekte 17. Een volledig begrip van VEGFR-2: ligand interacties is daarom belangrijk voor de ontwikkeling van remmers voor toepassing bij de behandeling van angiogenese-afhankelijke ziekten 18. Terwijl de meeste isovormen van VEGF-A binden aan VEGFR-2, proteolytische splitsing van VEGF-C en VEGF-D is vereist om een fragment dat uit de VEGF-homologie domein dat hoge affiniteit binden aan VEGFR-2 19,20 vertoont vrijgeven.
We hebben een bioassay liganden van VEGFR-2 die is ontworpen om de noodzaak van primaire endotheelcellen, die technisch moeilijk om doorgang, duur in aanschaf en cultuur omzeilen monitor (die gespecialiseerde gemiddeld) 21 ontwikkeld en tot expressie meerdere VEGFRs en geassocieerde co- receptoren 22. Heterodimerisatie van VEGFR-2 met andere VEGF-receptoren of co-receptoren kunnen ongewenste complexiteit veroorzaken wanneer gericht op study binary receptor-ligand interacties evalueren activiteit toegeschreven aan een specifieke receptor of het effect van remmende reagentia. 23. De bioassay behoudt mobiliteit van de relevante receptor in de celmembraan en maakt evaluatie van het vermogen van een ligand om te binden en verknopen van de VEGFR-2 extracellulaire gebied.
De bioassay gebaseerd op het creëren van een chimère receptor waarin het extracellulaire gebied van een VEGF-receptor (in casu VEGFR-2) is gefuseerd aan de transmembrane en intracellulaire gebieden van de erytropoëtine-receptor (EpoR), een lid van de cytokinereceptorfamilie 8,24. Dit fusie-eiwit wordt vervolgens uitgedrukt in een factor-afhankelijke pro-B cellijn Ba / F3, waarop stimulatie met ligand kan binden en verknopen van het extracellulaire domein van de receptor leidt tot activering van het cytoplasmatische effector regio, die in staat is transduceren een survival signaal via Janus kinase (JAK) naar cel te bevorderenoverleving en / of proliferatie. Daarentegen expressie van volledige lengte VEGFR-2 in hetzelfde celtype en stimulatie met ligand, is niet bevorderlijk voor celoverleving en proliferatie, wat aangeeft dat het proximale signalering effectoren van het VEGFR-2 route beschikbaar zijn in dit celtype.
We hebben de test gebruikt in verschillende contexten binding van nieuwe VEGFR-2 liganden 10,19,20,24-29 te verkennen. In combinatie met een VEGFR-3-EpoR-Ba / F3-assay, hebben we de relatieve activiteiten van de VEGF-C en VEGF-D groeifactoren voor binding en crosslinking VEGFR-2 en VEGFR-3 30 vergeleken. De assay is gebruikt om de remmende activiteit van neutraliserende monoklonale antilichamen tegen VEGFR-2 of VEGF-D, VEGFR-2 oplosbaar trap en peptidomimetica gericht op de VEGF-familie 31 karakteriseren. De test werd ook gebruikt om het vermogen van VEGF's van verschillende ORF virusstammen te binden en verknopen VEGFR-2 voor het testen in primaire endotheelcellen tonen <sup> 10,26. De test is bijzonder bruikbaar voor de snelle screening van mutanten van VEGF's die snel kunnen worden beoordeeld op activiteit voordat ze worden ingevoerd om de meer bewerkelijke endotheelcel assays 25 of bij de beoordeling protocollen voor het zuiveren groei factoren 27.
De test beschrijven we is gemakkelijk uit te voeren en de semi-kwantitatieve uitvoering maakt een snelle bepaling die soms nodig zijn bij het monitoren van de productie of zuivering van groeifactoren, antilichamen of oplosbare receptor domeinen andere experimenten. Het gebruiksgemak van de test maakt het een ideale aanvulling op verder en meer volledige studies uitgevoerd met primaire endotheelcellen afkomstig van bloed of lymfevaten van specifieke weefsels of orgaansystemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven assay gebaseerd op het gebruik van hoge levensvatbaarheid cellen, die afhankelijk groeifactoren. Cellen moeten daarom zorgvuldig gekweekt te zijn om te zorgen dat ze factor-afhankelijke, en expressie van de chimere receptor te behouden. Ervoor zorgen dat het medium is vers gemaakt en niet opgeslagen voor een te lange periode en dat WEHI-3D CM is zeer actief is belangrijk. Cellen moeten wel van IL-3 bevattend medium worden gewassen in het testmedium te verzekeren dat geen residuele IL-3 vervuilt …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.
Materials
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
| G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
| 3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
| Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
| Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
| 96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | N/A | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester |
| Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
| Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
| Fluorescence Reader | BioTek | N/A | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |
Referencias
- Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
- Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
- Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
- Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
- Korpelainen, E. I., Alitalo, K. Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).
- Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
- Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
- Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
- Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
- Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
- Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
- Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).
- Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
- Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
- Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
- Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
- Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
- Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
- Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
- McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
- Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
- Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
- Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
- Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
- Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
- Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
- Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
- Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
- Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
- Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
- Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
- Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).
