Un ensayo biológico simple para la Evaluación de Factores de Crecimiento Endotelial Vascular
Summary
Se describe un bioensayo sencillo basado en células para la detección, cuantificación y seguimiento de la actividad de los miembros de la familia del factor de crecimiento endotelial vascular de ligandos. El ensayo utiliza receptores quiméricos expresados en una línea celular dependiente de factor para proporcionar una evaluación semi-cuantitativa o cuantitativa de la unión al receptor y la reticulación por el ligando.
Abstract
El análisis de receptores tirosina quinasas y sus ligandos que interactúan implicadas en la biología vascular es a menudo difícil debido a la expresión constitutiva de familias de receptores relacionados, una amplia gama de ligandos relacionados, y la dificultad de tratar con cultivos primarios de células endoteliales especializadas. Aquí se describe un bioensayo para la detección de ligandos para el factor de crecimiento vascular endotelial receptor-2 (VEGFR-2), un transductor clave de las señales que promueven la angiogénesis y linfangiogénesis. Un ADNc que codifica una fusión de la región extracelular (de unión a ligando) de VEGFR-2 con la transmembrana y las regiones citoplásmicas del receptor de la eritropoyetina (EpoR) se expresa en la línea celular dependiente del factor de Ba / F3. Esta línea celular crece en presencia de interleucina-3 (IL-3) y la retirada de este factor de resultados en la muerte de las células dentro de 24 hr. La expresión de la / EpoR fusión del receptor VEGFR-2 proporciona un mecanismo alternativo para promover la supervivencia y potentiala proliferación de las células LLY Ba / F3 transfectadas de forma estable en presencia de un ligando capaz de unirse y reticulación de la porción extracelular de la proteína de fusión (es decir, uno que puede reticular la región extracelular de VEGFR-2). El ensayo se puede realizar de dos formas: un enfoque semi-cuantitativa en la que pequeños volúmenes de ligando y células permiten un resultado rápido en 24 horas, y un enfoque cuantitativo que implica marcadores sustitutos de un número de células viables. El ensayo es relativamente fácil de realizar, es muy sensible a conocidos VEGFR-2 ligandos y puede acomodar inhibidores extracelulares de VEGFR-2 de señalización tales como anticuerpos monoclonales para el receptor o ligandos, y las trampas de ligando soluble.
Introduction
La familia del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) de factores de crecimiento proteína secretada y sus receptores de la superficie celular afines es un grupo importante y diverso de ligandos solubles y los receptores de membrana embebido en, respectivamente, que la función en la transducción de señales a través de las membranas celulares. Funcionan principalmente en las células endoteliales sino también en las células de origen epitelial y las del sistema inmune 1,2. Vías de señalización contratados por los receptores activados por ligando VEGF (VEGFRs) son críticos en las principales patologías, como la degeneración y el cáncer macular relacionada con la edad, y la terapéutica dirigidas a ellos están en uso clínico frecuente (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal bevacizumab que se dirige a VEGF-A) 3,4.
Una de las complejidades de la familia VEGF es la diversidad de ligandos solubles presentes en la naturaleza (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, proteínas de VEGF codificadas por el ORF familia parapoxvirus y serpiente VEGF veneno, además de otra inhibitorioisoformas de VEGF-A) 2.
Estos ligandos interactúan con tres miembros de la familia de tirosina quinasas receptoras, a saber, VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3. Estos receptores se expresan de forma variable en diferentes tipos de células, pero a menudo se co-expresan en la superficie de las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos y linfáticos de todos los tamaños 5. VEGFR-2 se puede unir el mamífero ligandos de VEGF-A 6, VEGF-C y VEGF-7 D 8,9, así como virus orf VEGF 10 y veneno de serpiente VEGF 11. VEGFR-2 juega un papel importante en la conducción de la angiogénesis (crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos pre-existentes) en el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, el cáncer y enfermedades de los ojos. En estos contextos, los ligandos tales como VEGF-A, -C y -D se unen y activan el receptor en las células endoteliales vasculares sanguíneos 12-15. En las células endoteliales linfáticas, VEGFR-2 juega un papel en la linfangiogénesis, la formación de nuevos vasos linfáticos 16. VEGFR2 también puede promover la dilatación y expansión de las principales arterias y vasos linfáticos en los tejidos y la enfermedad 17 sanos. Una comprensión completa de VEGFR-2: interacciones ligando es por lo tanto importante para el desarrollo de inhibidores para uso en el tratamiento de enfermedades dependientes de la angiogénesis 18. Aunque la mayoría de las isoformas de VEGF-A se unen a VEGFR-2, se requiere la escisión proteolítica de VEGF-C y VEGF-D para liberar un fragmento que consiste en el dominio de homología de VEGF-que exhibe unión a VEGFR-2 19,20 alta afinidad.
Hemos desarrollado un bioensayo para monitorear ligandos de VEGFR-2 que está diseñado para eludir la necesidad de que las células primarias endoteliales, que son técnicamente difíciles de paso, que sean caros de comprar y la cultura (que requiere medio especializado) 21 y expresar múltiples VEGFR y co-asociado 22 receptores. Heterodimerización de VEGFR-2 con otros receptores de VEGF o co-receptores puede causar complejidad no deseada cuando se pretende espárragointeracciones Y binarios receptor-ligando, la evaluación de la actividad atribuible a un receptor específico, o que evalúan el efecto de los reactivos inhibidores. 23. El bioensayo conserva la movilidad del receptor relevante en la membrana celular y permite la evaluación de la capacidad de un ligando para unirse y reticular la región extracelular de VEGFR-2.
El bioensayo se basa en la creación de un receptor quimérico en el que la región extracelular de un receptor de VEGF (en este caso VEGFR-2) se fusiona a la transmembrana y regiones intracelulares del receptor de la eritropoyetina (EpoR), un miembro de la familia de receptores de citoquinas 8,24. Esta proteína de fusión se expresa entonces en la línea celular pro-B dependiente de factor Ba / F3, en la que la estimulación con un ligando capaz de unirse y de reticulación del dominio extracelular del receptor causa la activación de la región efector citoplasmático, que es capaz de la transducción de una señal de supervivencia a través de Janus quinasas (JAK) para promover la célulala supervivencia y / o proliferación. En contraste, la expresión de larga duración VEGFR-2 en el mismo tipo de células, y la estimulación con el ligando, no promueve la supervivencia y proliferación de las células, lo que indica que los efectores de señalización proximal de la vía de VEGFR-2 no están disponibles en este tipo de células.
Hemos utilizado el ensayo en una variedad de contextos para explorar la unión de nuevos VEGFR-2 ligandos 10,19,20,24-29. En combinación con un ensayo / F3 VEGFR-3-EpoR-Ba, hemos comparado las actividades relativas de la VEGF-C y factores de crecimiento VEGF-D para la unión y reticulación de VEGFR-2 y VEGFR-3 30. El ensayo se ha utilizado para caracterizar la actividad inhibidora de anticuerpos monoclonales neutralizantes para VEGFR-2 o VEGF-D, VEGFR-2 soluble trampa y peptidomiméticos dirigidos a la familia VEGF 31. El ensayo también se utilizó para mostrar la capacidad del VEGF de diferentes cepas de virus orf para atar y reticular VEGFR-2 antes de la prueba en las células endoteliales primarias <sarriba> 10,26. El ensayo es particularmente útil para la detección rápida de mutantes de VEGF que puede ser evaluado rápidamente para la actividad antes de que se introducen en los ensayos de células endoteliales más laboriosas 25 o la hora de evaluar los protocolos para el crecimiento de purificación de factores de 27.
El ensayo se describe es fácil de realizar, y la versión semi-cuantitativa permite determinaciones rápidas que a veces se requieren cuando el control de la producción o purificación de factores de crecimiento, anticuerpos o dominios de receptores solubles para otros experimentos. La facilidad de uso del ensayo hace que sea un complemento ideal para los estudios más y más completos realizados con células endoteliales primarias derivadas de la sangre o los vasos linfáticos de los tejidos específicos o sistemas de órganos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo descrito aquí se basa en el uso de células de alta viabilidad, que son dependientes de factores de crecimiento. Por lo tanto, las células tienen que ser cuidadosamente cultivadas para asegurar que son dependiente del factor, y conservan la expresión del receptor quimérico. Asegurar que el medio está recién hecha y no se almacena por un período excesivamente largo y que WEHI-CM 3D es altamente activo es importante. Las células necesitan ser lavados a fondo de IL-3 que contiene el medio en el medio de e…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.
Materials
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
| G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
| 3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
| Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
| Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
| 96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | N/A | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester |
| Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
| Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
| Fluorescence Reader | BioTek | N/A | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |
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