Die Erzeugung von Microtumors Mit 3D Human Biogel Kultursystem und Patienten stammGlioblastomZellen für Kinomic Profilieren and Drug Response-Testing
Summary
Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.
Abstract
The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.
Introduction
Die häufigsten primären intrakraniellen bösartigen Hirntumoren sind Grad III Astrozytome und Grad IV Glioblastom (Glioblastom oder GBM). Diese Tumoren bieten schlechten Prognosen mit Median Ein-Jahres – Überlebensrate zwischen 12 bis 15 Monaten bei den derzeitigen Therapien für GBM in den USA 1-3. Multimodalität Therapien umfassen Chirurgie, Strahlentherapie und Chemotherapie einschließlich Temozolomid (TMZ) und Kinase-bezogenen Mittel. Kinase Signalgebung in GBM, einschließlich Teilmengen von Tumoren mit Amplifikation oder aktivierende Mutationen in den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), erhöht sich in Platelet Derived Growth Factor Receptor (PDGFR) Signalisieren, erhöht Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase (PI3K) häufig dysreguliert und Unterstützung Tumor 4-6 angiogenen Signalisierung durch Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR) sowie andere Kinase angetrieben Wege. Aktuelle In – vitro und de – vivo – Modellen diese repräsentativen Veränderungen häufig verlieren <sup> 7. Darüber hinaus hat genetische Profilierung nicht die erwarteten Vorteile angeboten, die die Tatsache, dass genetische und epigenetische Veränderungen Veränderungen auf der Ebene der Proteinaktivität vorhersagen, nicht immer widerspiegeln kann, wo die meisten Kinase Mittel wirken direkt und wo Therapien mit anderen Wirkmechanismen wirken können Targeting indirekt.
Die traditionelle immortalisierte Zelllinie, die ad infinitum agiert werden kann, ist seit langem der Standard für Drogentests aufgrund ihrer Wartungsfreundlichkeit und Reproduzierbarkeit. Jedoch leidet dieses Modell von einem hohen Nährstoff (und künstliche) Wachstumsumgebung, die Zellen für schnell wachsende, die sich stark von dem ursprünglichen Tumor auswählt. Als solches hat es bei der Entwicklung realistischer Modellsysteme ein beträchtliches Interesse, die ein komplexeres Tumor biologischen System reflektieren als in dem Patienten vorhanden ist. Tumorxenografte bei Mäusen gezüchtet direkt aus einem Primärtumor entwickelt ( "xenoline" Patienten stamm Xenotransplantat oder PDX) provide ein reflektierter Modellsystem, insbesondere im Rahmen von Krebstherapeutika, da sie zuverlässiger klinischer Erfolg vorhersagen , sind zu spüren. 8 Trotz der reflexions Biologie, diese Modelle sind teuer und schwierig herzustellen und aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus sind sie Hochdurchsatz-Untersuchungen nicht zugänglich. Die Notwendigkeit, eine bessere biologische Modelle zu entwickeln, die genauer molekularen Veränderungen in den primären Tumoren reflektieren und zu profilieren und diese Modelle durch direkte Maßnahmen der Kinaseaktivität zu testen, nicht genetische Marker Surrogat, ist klar.
Es ist bekannt , dass im Gegensatz zu zweidimensionalen (2D) Monolayer – Kulturen, 3D oder mehrzelligen Testmodellen mehr physiologisch relevanten Endpunkten 9-11 bereitstellen kann. Gemeinsame 3D-Kultur Ansätze beinhalten Matrix beschichteten Mikrocarriern und Zell Sphäroidformation. Tumorsphäroide kann über zelluläre Aggregation mit Rührflasche, pHEMA Platte und Hänge Drop-Techniken erzeugt werden. Einschränkungen für tiese Ansätze umfassen: Unfähigkeit für einige Zellen stabil Sphäroiden, Variabilität in Wachstum und Herausforderungen mit gemischten Zelltypen zu bilden. Alternativ 12-14 viele synthetische (Hydrogel – Polymer) und tierischen Ursprungs Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Matrix aus Maus – Sarkome, Rinder – Kollagen) Matrizen entwickelt wurden , für die 3D – Kultur studiert. Maus – EHS – Matrix weitgehend verwendet wird , aber bekannten Zellwachstum und die Differenzierung in vitro zu fördern , und in vivo 15.
Um 3D – Tumorbiologie zu replizieren, wurde ein Mensch Biomatrix System von Dr. Raj Singh et al. Entwickelte 16. Die natürliche, Wachstumsfaktor-freien menschlichen Biogel ermöglicht 3D-Kultur Gerüste (Perlen, Scheiben), die Langzeitkultivierung von mehreren Zelltypen unterstützen. Eine Reihe von 3D menschlichen Biogel Kultur Designs sind für die Untersuchung von Tumorwachstum, Adhäsion, Angiogenese und Invasion Eigenschaften etabliert. Vorteile und Eigenschaften der menschlichen Biogel im Vergleich zu gemeinsamenMaus – EHS – Gele sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 zusammengefasst.
| Quelle: | Menschliche Amnion (gepoolte Gewebe) Pathogen-frei, IRB frei / genehmigt |
| ECM Natur: | Nichtdenaturierter Biogel (GLP-Produktion) |
| Schlüssel Komponenten: | Col-I (38%), Laminin (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), Entactin & HSPG (<3%) |
| GF frei: | Undetectable EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogenen, ungiftiger) |
Tabelle 1: Eigenschaften der Menschen Biogel als Common EHS Gele verglichen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = "always">Tabelle 2: Die Vorteile der Menschen Biogel als Common EHS Gele verglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls betreffen überwiegend Generation zu microtumor sowie Medikamentendosierung und Wartung. Da die microtumor Perlen zerbrechlich sind und leicht zerrissen, ist äußerste Sorgfalt in den beiden Entwicklungsstadien eines Tests und Wartung erforderlich. Wenn ein Fehler während einer dieser Prozesse auftritt, kann experimentell Interpretation beeinträchtigt werden, was zu Nebenstelle oder eine unnötige Wiederholung der Experimente oder sogar Ausschluss von Daten.
<p class="j…Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützt von NIH R21 Zuschuss (PI: C. Willey, CA185712-01), Brain Tumor SPORE Auszeichnung (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) und SBIR Vertrag (PI: R. Singh, N43CO-2.013-00.026).
Materials
| Collagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Trypsin EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x final concentration |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A | Life Technologies | 12587-010 | 1x final concentration |
| Recombinant Human FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/mL final concentration |
| Recombinant Human EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/mL final concentration |
| L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM final concentration |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 ug/mL final concentration |
| Penicillin Streptomycin | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/mL Penicillin G, 100 ug/mL Streptomycin final concentration |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/mL final concentration |
| MTT | Life Technologies | M6494 | prepared to 5 mg/mL in PBS and sterile filtered, 1 mg/mL in well |
| SDS | Fisher | BP166 | for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01M HCL, 5% in well |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, prepared to 0.01M with SDS, 5 mM in well |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 uM in PBS staining solution, 1 uM in well |
| Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail | Pierce ThermoScientific | 78420 | 1:100 ratio in MPER |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 ratio in MPER |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds |
| Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture) |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash) |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Protocol | 032-060 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
| PTK kinase buffer | PamGene | 36000 | 300 µl 10X PK buffer stock in 2.7 ml dH20, catalog number for PTK reagent kit |
| ATP | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PTK Additive | PamGene | 32114 | |
| PTK-MM1 tube (10X BSA) | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
| STK kinase buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 tube (100X BSA) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| Equipment | |||
| #11 Blades, sterile | Fisher | 3120030 | |
| #3 scalpel handles, sterile | Fisher | 08-913-5 | |
| 100mm glass Petri dishes | Fisher | 08-748D | |
| Semicurved forceps | Fisher | 12-460-318 | |
| Trypsinizing flask | Fisher | 10-042-12B | |
| Magnetic stirrer | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" stir bar | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D cell strainer | Fisher | #352340 | |
| B-D 50ml Centrifuge tube | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 kinomic analysis software | PamGene | ||
| Evolve Kinase Assay Software | PamGene | ||
| UpKin App software (upstream kinase prediction) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | with 10 mL disposable HARV |
Referencias
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