Kinomic 프로파일 의약품 응답 테스트를위한 3D 인간의를 Biogel 문화 시스템을 사용 Microtumors 및 환자 유래 아교 모세포종 세포의 생성
Summary
Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.
Abstract
The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.
Introduction
가장 일반적인 기본 두개 내 악성 뇌 종양은 등급 III 성상 세포종과 등급 IV의 아교 모세포종의 홍반 (아교 모세포종 또는 GBM)입니다. 미국 1-3 GBM 현재 치료와 15개월 -이 종양은 12 사이의 평균 일 년 생존율 가난한 예후를 제공합니다. Multimodality 치료는 테모 졸로 마이드 (TMZ) 및 키나제 타겟 에이전트를 포함한 수술, 방사선, 화학 요법 등이 있습니다. 키나제 신호는 자주 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR)의 증가 신호 증가 포스파티딜 이노시톨-3 키나아제 (PI3K)과의 증폭과 종양의 하위 집합 또는 활성화 돌연변이를 포함, GBM에서 조절 곤란된다 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR)뿐만 아니라 기타 키나아제 중심 경로를 통해 혈관 신생 4-6 시그널링을 지원 종양. 생체 외 및 생체 내 모델은 자주이 대표 변경을 잃을 현재 <SUP> 7. 또한, 유전 적 프로파일 유전 및 후생 유전 학적 변화는 항상 제 타겟팅 가장 키나아제 직접 작용 단백질 활성의 수준에서의 변화를 예측할 수없고, 동작의 다른 메커니즘 요법 여기서 작용할 수 있다는 사실을 반영 예상 이익을 제공하지 간접적으로.
무한히 계대 수있는 전통적인 불멸화 세포주 긴 인한 유지 및 재현성의 용이성에 약물 시험을위한 표준이었다. 그러나이 모델은 빠르게 원래의 종양에서 크게 차이가 세포 성장을 위해 선택하는 고 영양 (인공) 성장 환경에서 겪고있다. 이와 같이, 환자에 존재하는 등의보다 복잡한 종양 생물학적 시스템을 반영보다 현실적인 모델 시스템을 개발하는데 상당한 관심이 있었다. 종양 이종 이식 생쥐에서 자란 차 종양 ( "xenoline,"환자 유래의 이종 이식 또는 PDX) 있습니다 provi에서 직접 개발이들은보다 확실 임상 적 성공을 예측. 8 이상의 반사 생물학 불구 생각대로 데 특히 암 치료제의 설정에서 더 반사 모델 시스템은, 이러한 모델은 고가이며 수립하고 유지하기 어렵다. 또한, 이들은 높은 처리량 연구 의무가 없다. 필요성이 더 더 정확하게 유전자 마커를 대리하지, 기본 종양에서 분자 변화를 반영하고, 프로파일 및 키나제 활성을 직접 측정을 사용하여 이러한 모델을 테스트 생물학적 모델을 개발하기 위해 분명하다.
이 아니라 2 차원 단층 배양과는 달리, 3 차원 또는 다세포 분석 모델보다 생리 관련 엔드 9-11을 제공 할 수 있다고 인식된다. 일반적인 3D 배양 기질 코팅 미세 전달체 셀 타원체 형성을 수반 접근한다. 종양 타원체는 스피너 플라스크, PHEMA 플레이트를 사용하여 드롭 기술을 걸려 휴대 집계를 통해 생성 할 수 있습니다. t에 대한 제한 사항HESE 방법은 다음과 같습니다 : 일부 세포가 혼합 된 세포 유형으로 안정된 회전 타원체, 변동 성장과 도전을 형성 할 수 없음을. 또한, 많은 합성 (하이드로 겔 폴리머) 및 Engelbreth가-홀름 – 떼 행렬이 3D 문화를 위해 개발 된 마우스 육종에서 (EHS) 행렬, 소 콜라겐)이 12 ~ 14을 연구하는 동물 유래. 마우스 EHS 행렬은 광범위하게 사용되고 있지만, 시험 관내 및 생체 내 (15)에 세포 증식 및 분화를 촉진하는 것으로 알려져있다.
3D 종양 생물학을 복제하기 위해, 인간 biomatrix 시스템 박사 라즈 싱 등. (16)에 의해 개발되었다. 천연 성장 인자없이 인체를 Biogel 여러 종류의 세포의 장기 배양을 지원 3D 배양 지지체 (비드, 디스크)를 허용한다. 3D 인간의를 Biogel 문화 디자인의 일련의 종양 성장, 접착, 혈관 신생과 침략 속성을 공부 설정됩니다. 장점과 인간의를 Biogel의 특성을 일반에 비해마우스 EHS 겔은 표 1 및 표 2에 요약되어있다.
| 출처: | 인간 Amnions (풀링 조직) 병원체가없는, IRB 면제는 / 승인 |
| ECM 자연 : | 비 변성를 Biogel (GLP-생산) |
| 키 구성 요소 : | COL-I (38 %), 라미닌 (22 %), COL-IV (20 %), COL-III (7 %) 및 Entactin HSPG (<3 %) |
| GF-무료 : | 탐지 EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (비 혈관, 비 독성) |
표 1 : 일반 EHS 젤에 비해 인간의 등록 정보를 Biogel.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-wi일 – next.within 페이지 = "항상">표 2 : 일반 EHS 젤에 비해 인간를 Biogel 장점.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜 내에서 중요한 단계는 주로 생성뿐만 아니라 약물 투여 및 유지 microtumor에 관한 것이다. microtumor 비즈 깨지기 쉽게 찢어 때문에, 극도의주의는 분석 및 유지 보수의 발달 단계에 모두 필요합니다. 에러가 이러한 공정 중 하나가 발생했을 경우, 실험 해석 확장하거나 불필요한 반복 실험 데이터 또는 심지어 배제를 초래 손상 될 수있다.
수정 및 문제 해결, 특히 microtu…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
, 뇌 종양 SPORE 상 (PD : GY 길레스피, P20CA 151129-03)과 SBIR 계약 (PI : R. 싱, N43CO-2013-00026) : NIH R21 부여 (C. Willey, CA185712-01 PI)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Collagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Trypsin EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x final concentration |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A | Life Technologies | 12587-010 | 1x final concentration |
| Recombinant Human FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/mL final concentration |
| Recombinant Human EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/mL final concentration |
| L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM final concentration |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 ug/mL final concentration |
| Penicillin Streptomycin | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/mL Penicillin G, 100 ug/mL Streptomycin final concentration |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/mL final concentration |
| MTT | Life Technologies | M6494 | prepared to 5 mg/mL in PBS and sterile filtered, 1 mg/mL in well |
| SDS | Fisher | BP166 | for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01M HCL, 5% in well |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, prepared to 0.01M with SDS, 5 mM in well |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 uM in PBS staining solution, 1 uM in well |
| Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail | Pierce ThermoScientific | 78420 | 1:100 ratio in MPER |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 ratio in MPER |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds |
| Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture) |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash) |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Protocol | 032-060 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
| PTK kinase buffer | PamGene | 36000 | 300 µl 10X PK buffer stock in 2.7 ml dH20, catalog number for PTK reagent kit |
| ATP | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PTK Additive | PamGene | 32114 | |
| PTK-MM1 tube (10X BSA) | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
| STK kinase buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 tube (100X BSA) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| Equipment | |||
| #11 Blades, sterile | Fisher | 3120030 | |
| #3 scalpel handles, sterile | Fisher | 08-913-5 | |
| 100mm glass Petri dishes | Fisher | 08-748D | |
| Semicurved forceps | Fisher | 12-460-318 | |
| Trypsinizing flask | Fisher | 10-042-12B | |
| Magnetic stirrer | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" stir bar | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D cell strainer | Fisher | #352340 | |
| B-D 50ml Centrifuge tube | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 kinomic analysis software | PamGene | ||
| Evolve Kinase Assay Software | PamGene | ||
| UpKin App software (upstream kinase prediction) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | with 10 mL disposable HARV |
Referencias
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