Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.
The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.
De meest voorkomende primaire intracraniële kwaadaardige hersentumoren zijn rang III astrocytomen en graad IV glioblastoma multiforme (glioblastoma of GBM). Deze tumoren bieden slechte prognose met een mediane één-jaars overleving tussen 12-15 maanden met de huidige therapieën voor GBM in de VS 1-3. Multimodaliteit behandelingen omvatten chirurgie, bestraling en chemotherapie waaronder temozolomide (TMZ) en-kinase gerichte agenten. Kinase signalering is vaak verstoord bij GBM, waaronder subgroepen van tumoren met amplificatie of activerende mutaties in het epidermale groeifactorreceptor (EGFR), verhogingen Platelet Derived Growth Factor Receptor (PDGFR) signalering, verhoogde fosfatidyl-inositol-3-kinase (PI3K) en tumor ondersteunen angiogene signalering door middel Vasculaire Endotheliale groei Factor receptor (VEGFR) en andere kinase pathways gedreven 4-6. Huidige in vitro es in vivo modellen vaak verliezen deze representatieve veranderingen <sup> 7. Daarnaast heeft genetische profielen niet aangeboden de verwachte voordelen kan het feit weerspiegelen dat genetische en epigenetische veranderingen wijzigingen niet altijd voorspellen op het niveau van eiwit activiteit, waar de meeste kinase richtende middelen direct werken, en wanneer therapieën met andere werkingsmechanismen kunnen fungeren indirect.
De traditionele geïmmortaliseerde cellijn die kan worden gepasseerd eindeloos is al lang de standaard voor drug tests om goede houdbaarheid en reproduceerbaarheid. Echter, dit model lijdt aan een hoge nutriënt (en kunstmatige) groei omgeving die kiest voor het snel groeiende cellen die sterk afwijken van de oorspronkelijke tumor. Als zodanig is er aanzienlijke belangstelling voor de ontwikkeling realistischer modelsystemen die een complexere tumor biologisch systeem reflecteren zoals aanwezig in de patiënt is. Tumorxenograften direct ontwikkeld van een primaire tumor gegroeid in muizen ( "xenoline," patiënt afgeleide xenograft of PDX) provide een reflectief modelsysteem, met name in de context van kanker therapeutica, zoals zij geacht worden klinisch succes meer betrouwbare voorspelling. 8 Ondanks een reflecterende biologie, deze modellen zijn duur en zijn moeilijk vast te stellen en te onderhouden. Bovendien zijn zij niet vatbaar zijn voor high-throughput studies. De noodzaak om biologische modellen die een betere weerspiegeling van moleculaire veranderingen in de primaire tumoren, en naar het profiel en test deze modellen met behulp van directe metingen van kinase-activiteit, niet surrogaat genetische merkers beter te ontwikkelen, is duidelijk.
Het is algemeen bekend dat in tegenstelling tot tweedimensionale (2D) monolaag culturen, 3D of meercellige assay modellen kunnen meer fysiologisch bieden relevante eindpunten 9-11. Common 3D cultuur benaderingen betrekken-matrix gecoate microdragers en de vorming cel sferoïde. Bolvormige tumoren kunnen worden gegenereerd via cellulaire aggregatie met behulp van centrifugekolf, pHEMA bord en opknoping druppel technieken. Beperkingen voor teze benaderingen omvatten: de onmogelijkheid voor een aantal cellen om stabiele sferoïden, variabiliteit in de groei en uitdagingen met gemengde celtypen te vormen. Als alternatief, vele synthetische (hydrogel, polymeer) en dierlijke-afgeleide Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix van muis sarcomen, runder collageen) matrices zijn ontwikkeld voor 3D-cultuur bestudeert 12-14. Muis EHS matrix wordt uitgebreid gebruikt maar bekende celgroei en differentiatie bevorderen in vitro es in vivo 15.
Om 3D tumorbiologie repliceren, werd een menselijke biomatrix ontwikkeld door Dr. Raj Singh et al. 16. De natuurlijke, groeifactor-vrij mens Biogel maakt 3D-cultuur steigers (kralen, schijven), die op lange termijn de teelt van meerdere celtypen te ondersteunen. Een reeks 3D menselijke Biogel cultuur ontwerpen worden vastgesteld voor het bestuderen van tumorgroei, adhesie, angiogenese en invasie eigenschappen. Voordelen en eigenschappen van menselijke Biogel vergeleken met gewonemuis EHS gels worden samengevat in tabel 1 es tabel 2.
Bron: | Human Amnions (Pooled weefsel) Pathogeen-vrij, IRB-vrijgestelde / goedgekeurde |
ECM natuur: | Niet-gedenatureerde Biogel (GLP-productie) |
sleutel componenten: | Col-I (38%), laminine (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), entactine en HSPG (<3%) |
GF-vrij: | Undetectable EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogene niet-toxisch) |
Tabel 1: Eigenschappen van Human Biogel als Vergeleken met Common EHS Gels.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = "always">Tabel 2: Voordelen van Human Biogel als Vergeleken met Common EHS Gels.
Kritische stappen in het protocol voornamelijk betrekking op productie, en dosering van geneesmiddelen en onderhoud microtumor. Omdat de microtumor kralen zijn kwetsbaar en gemakkelijk gescheurd, is uiterste zorg nodig beide ontwikkelingsstadia van een test en onderhoud. Indien tijdens een van deze processen een fout optreedt, kan experimenteel interpretatie worden aangetast, waardoor verlenging of onnodige herhaling van experimenten of zelfs van gegevenssets.
Wijzigingen en het oplossen van…
The authors have nothing to disclose.
Ondersteund door NIH-subsidie R21 (PI: C. Willey, CA185712-01), hersentumor SPORE award (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) en SBIR contract (PI: R. Singh, N43CO-2013-00026).
Collagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
Trypsin EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
N-2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x final concentration |
B-27 Supplement w/o Vitamin A | Life Technologies | 12587-010 | 1x final concentration |
Recombinant Human FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/mL final concentration |
Recombinant Human EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/mL final concentration |
L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM final concentration |
Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 ug/mL final concentration |
Penicillin Streptomycin | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/mL Penicillin G, 100 ug/mL Streptomycin final concentration |
Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/mL final concentration |
MTT | Life Technologies | M6494 | prepared to 5 mg/mL in PBS and sterile filtered, 1 mg/mL in well |
SDS | Fisher | BP166 | for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01M HCL, 5% in well |
HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, prepared to 0.01M with SDS, 5 mM in well |
Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 uM in PBS staining solution, 1 uM in well |
Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail | Pierce ThermoScientific | 78420 | 1:100 ratio in MPER |
Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 ratio in MPER |
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
DMSO | Fisher | BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds |
Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture) |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash) |
10% Neutral Buffered Formalin | Protocol | 032-060 | |
Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
PTK kinase buffer | PamGene | 36000 | 300 µl 10X PK buffer stock in 2.7 ml dH20, catalog number for PTK reagent kit |
ATP | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
PTK Additive | PamGene | 32114 | |
PTK-MM1 tube (10X BSA) | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
STK kinase buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
STK-MM1 tube (100X BSA) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
Equipment | |||
#11 Blades, sterile | Fisher | 3120030 | |
#3 scalpel handles, sterile | Fisher | 08-913-5 | |
100mm glass Petri dishes | Fisher | 08-748D | |
Semicurved forceps | Fisher | 12-460-318 | |
Trypsinizing flask | Fisher | 10-042-12B | |
Magnetic stirrer | Fisher | 14-490-200 | |
3/4" stir bar | Fisher | 14-512-125 | |
B-D cell strainer | Fisher | #352340 | |
B-D 50ml Centrifuge tube | Fisher | #352098 | |
PamStation 12 | PamGene | ||
BioNavigator 6.0 kinomic analysis software | PamGene | ||
Evolve Kinase Assay Software | PamGene | ||
UpKin App software (upstream kinase prediction) | PamGene | ||
gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | with 10 mL disposable HARV |