Spazi di giunzione intercellulare di comunicazione: un biomarker funzionale per valutare gli effetti avversi dei tossici e tossine, e benefici per la salute di prodotti naturali

Summary

Questo protocollo descrive una tecnica di trasferimento di carico bisturi-colorante fluorescente che misura la comunicazione intercellulare attraverso i canali gap junction. Gap giunzionale comunicazione intercellulare è un importante processo cellulare attraverso il quale l'omeostasi tissutale è mantenuto e la rottura di questa segnalazione cellulare ha effetti negativi sulla salute.

Abstract

Questo protocollo descrive un bisturi loading fluorescente trasferimento della tintura tecnica (SL-DT) che misura la comunicazione intercellulare attraverso canali di giunzione gap, che è un importante processo intercellulare attraverso cui omeostasi tessuto sia conservato. Interruzione di spazi di giunzione comunicazione intercellulare (GJIC) di sostanze tossiche, tossine, farmaci, ecc è stato collegato a numerosi effetti negativi sulla salute. Molte malattie umane genetiche basata sono state legate a mutazioni in geni gap junction. La tecnica SL-DT è un semplice saggio funzionale per la valutazione simultanea GJIC in una grande popolazione di cellule. Il test prevede cellule pre-caricamento con un colorante fluorescente perturbando brevemente la membrana cellulare con una lama di bisturi attraverso una popolazione di cellule. Il colorante fluorescente è quindi consentito di attraversare attraverso canali di giunzione gap celle adiacenti per un tempo designato. Il saggio viene quindi interrotta mediante aggiunta di formalina alle cellule. La diffusione del fluocolorante fluore- attraverso una popolazione di cellule è valutato con un microscopio a epifluorescenza e le immagini vengono analizzate con qualsiasi numero di pacchetti software morfometrici che sono disponibili, tra cui pacchetti di software libero presenti sul dominio pubblico. Questo test è stato adattato per gli studi in vivo utilizzando fette di tessuto da vari organi da animali trattati. In generale, il dosaggio SL-DT può servire una vasta gamma di esigenze farmacologiche e tossicologiche in vitro, e può essere potenzialmente adatto per sistemi set-up high throughput con l'imaging microscopia a fluorescenza automatizzato e analisi di chiarire più campioni in un tempo più breve.

Introduction

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire una tecnica semplice, completo e relativamente poco costoso per valutare i potenziali tossicità di composti. Questo è un approccio in vitro che possono essere utilizzati in molteplici linee cellulari. laboratori di biologia delle cellule standard dotate di microscopi epifluorescenza possono condurre una ricerca utilizzando questo test.

La nostra conoscenza di base delle funzioni cellulari è stato fortemente dipendente test biologici in vitro, ed è diventato una componente essenziale nelle valutazioni tossicologiche dei prodotti farmaceutici, inquinanti ambientali e contaminanti alimentari nato. Purtroppo, non esiste un unico sistema in vitro nel saggio biologico che può ampiamente soddisfare le richieste di tutte le valutazioni tossicologiche. Molti test in vitro sono progettati e ottimizzati per valutare e valutare uno specifico endpoint biochimica o molecolare. Questi sono spesso combinati in un flusso elevato impostato per riflettere una perturbazione di uncerto trasduzione del segnale, come ad esempio recettore per gli estrogeni segnalazione ^1. Questa strategia ha avuto un discreto successo, ma il vasto numero di vie di trasduzione del segnale coinvolti nella espressione genica rende il compito di scegliere un percorso di segnalazione specifica per valutare abbastanza complessa. Alte protocolli through-put sono attualmente in fase di sviluppo e utilizzati per misurare simultaneamente numerose vie di segnalazione, che è stato uno approccio per superare alcuni dei limiti dei singoli test. Tuttavia, non tutte le vie di segnalazione sono stati inseriti con successo in approcci più completi, oltre a nuove vie di segnalazione sono costantemente scoperto che complica ulteriormente il processo di valutazione. Utilizzando i numeri ampi di approcci in vitro, particolarmente elevato through-put sistemi, per le valutazioni tossicologiche complete sono anche molto costosi e non sono favorevoli alla più unico investigatore condotto progetti di ricerca.

GJIC è un processo tightly controllato da variazioni di tensione, concentrazione di calcio, pH, redox equilibrio, regolamentati da importanti vie di trasduzione del segnale intracellulare e le interazioni con la membrana e citoscheletro proteine ^2,3. Quindi, l'inibizione della GJIC può riflettere i diversi tipi di stress cellulare, interruzione delle diverse funzioni cellulari, o perturbazioni di diverse vie di trasduzione del segnale. Un altro approccio per superare l'uso di limitate biosaggi trasduzione del segnale è di sfruttare i fenomeni biologici che molti, se non la maggior parte, trasduzione del segnale sono ulteriormente modulati da sistemi di segnalazione intercellulari cooperativi attraverso canali gap junction ^4-8. Sebbene i sistemi di segnalazione intercellulari sono anche numerose e sotto controllo percorso multiplo, la segnalazione intercellulare attraverso canali di giunzione gap è in definitiva una funzione dei canali essendo aperto, parzialmente chiusa o completamente chiusa. Questo fornisce un punto finale che può essere facilmente misurata utilizzando diversinei sistemi di saggi biologici in vitro ^7. Considerando che il set point di un tessuto omeostatico richiede canali aperti, determinare l'effetto dei composti su spazi di giunzione comunicazione intercellulare (GJIC) è un approccio più completo nel determinare i potenziali effetti tossici dei composti ^4,8. In sostanza, questo fenomeno biologico fondamentale che svolge un ruolo centrale nel coordinamento più eventi di trasduzione del segnale che controllano l'espressione genica permette una ampia valutazione degli effetti tossici. Così, test biologici che valutano GJIC sono un ottimo punto di partenza per valutare il potenziale tossicità dei composti.

I più estese tecniche utilizzate per valutare GJIC sono basati su precarico cellule con una sonda fluorescente e poi per controllare la migrazione del colorante dalla cella caricato o celle alle celle adiacenti. Tecniche per precaricare il colorante hanno coinvolto microiniezione ^9, raschiare carico ^10, e metilici esteri delle sonde ¹¹ </sup>. Il bisturi loading fluorescente trasferimento della tintura metodo (SL-DT) è una modifica del carico raschiatura – colorante assay transfer sviluppato da El Fouly ^10. Piuttosto che il raschiare più invasivo, il metodo bisturi carico di questo rapporto implica un dolce rotolo di un bisturi con lama circolare attraverso un monostrato di cellule che riducano al minimo i danni invasiva (Figura 1). I vantaggi di questa tecnica sono la valutazione tossicologica di una popolazione di cellule piuttosto che singole cellule del dosaggio microiniezione. Inoltre, la semplicità di questo test consente la rapida rilevazione di più lastre in breve tempo mentre i metodi che utilizzano tecniche di microiniezione e tecniche che utilizzano gli esteri metilici di sonde fluorescenti sono significativamente più tempo e richiedono livello di abilità notevolmente superiore.

Anche se non esiste un unico metodo per soddisfare tutte le esigenze di studio GJIC; il saggio SL-DT è un test semplice, piuttosto economico e versatile che puòsoddisfare molte delle esigenze per le valutazioni iniziali di tossicità di vari composti. I principali vantaggi sono: semplicità, senza particolare bisogno di attrezzature o le competenze che sono necessarie per altri metodi come la microiniezione, recupero fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) analisi e attivazione locale di saggi sonda fluorescente molecolare, una valutazione rapida e simultanea di GJIC in una grande numero di cellule, favorisce un alto rendimento set-up con imaging di fluorescenza automatizzata microscopia ed analisi, nonché la sua adattabilità per studi in vivo.

Protocol

Il protocollo per questo studio è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo dei National Institutes of Health Sciences del Giappone, che è dove in vivo esperimenti sono stati fatti, per assicurare che i ratti sono stati trattati umanamente e con riguardo per alleviare le sofferenze. 1. SL-DT Bioassay Seed 3 x 10 5 WB-F344 cellule epiteliali di fegato di ratto Onto 35 piastre di coltura mm di diametro contenenti Eagles modificati medie più il 5% di siero fe…

Representative Results

Interruzione di GJIC è stato ampiamente utilizzato come biomarker per l'identificazione di composti tossici a, il livello epigenetico non genotossica di controllo gene che induce effetti negativi sulla salute 14. Ad esempio, idrocarburi aromatici policiclici (PAH) sono contaminanti ubiquitari dell'ambiente ma variano nelle loro tossicità epigenetiche in funzione delle loro strutture molecolari 15. I PAH di peso molecolare inferiore si trovano tipicamente a…

Discussion

Il saggio SL-DT è una tecnica semplice e versatile in misura GJIC, ma ci sono diverse preoccupazioni critiche che dovrebbero essere contabilizzati nella progettazione di adeguati protocolli sperimentali. Per misurazioni affidabili di GJIC utilizzando il test SL-DT ci deve essere una buona diffusione tintura della LY attraverso giunzioni delle cellule. Come minimo, un tempo adeguato deve essere scelto per assicurare che il colorante si diffonde attraverso otto o più righe di celle dalle cellule bisturi caricata in entr…

Materials

WB-F344 rat liver epithelial cells	From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC)	none	Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC
35 mm Culture Plates	Corning	430165
25 cm2 culture flasks	Corning	430639
75 cm2 culture flasks	Corning	430641
D-medium, an Eagles modified medium	ThermoFisher/GIBCO	Formula No. 78-5470EF
fetal bovine serum	ThermoFisher/GIBCO	10437
0.25% trypsin-EDTA	ThermoFisher/GIBCO	15050
phosphate buffered saline	homemade	see below for ingredient cat#'s	137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4
KCl	JT Baker – Mallinckrodt	3040-01
NaCl	JT Baker – Mallinckrodt	3624-05
Na2HPO4	JT Baker – Mallinckrodt	3819–01
KH2PO4	JT Baker – Mallinckrodt	3246-01
Lucifer Yellow CH, lithium salt	Sigma-Aldrich Chemical	L0259
rhodamine-dextran	Sigma-Aldrich Chemical	R9379
1-methylanthracene	Sigma-Aldrich Chemical
phenanthrene	Sigma-Aldrich Chemical	P11409
resveratrol	Sigma-Aldrich Chemical	R5010
D609	Tocris Bioscience	1437
acetonitril	EMD	AX0145-1
37% solution formaldehyde	JT Baker – Mallinckrodt	2106-01
#20 surgical blade	Fine Science Tools Inc.	10317-14
50 mL conical sterile tubes	Thermo scientific	339652
Nikon epifluorescence microscope	Nikon -Mager Scientific	Eclipse TE300
Nikon FITC dichroic cube	Nikon -Mager Scientific	96107
CCD camera	Nikon -Mager Scientific	Nikon Cool Snap EZ CCD
imaging system.	Nikon -Mager Scientific	Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system.
Image J	National Institute of Health	http://imagej.nih.gov/ij/