ギャップ結合細胞間コミュニケーション：毒物および毒素の有害効果を評価するための機能バイオマーカー、および天然物の健康上の利点
Summary
このプロトコルは、ギャップ結合チャネルを介して細胞間通信を測定メスローディング蛍光色素転写技術が記載されています。ギャップジャンクション間の通信は、組織の恒常性を維持し、この細胞シグナル伝達の破壊は健康への悪影響がありますされる主要な細胞プロセスです。
Abstract
このプロトコルは、組織の恒常性が維持されることにより、主要な細胞間プロセスであるギャップ結合チャネルを介して細胞間の通信を、測定メスローディング蛍光色素転写（SL-DT）技術が記載されています。 などの毒物、毒素、薬物によるギャップ結合細胞間コミュニケーション（GJIC）の中断は、多くの健康への悪影響にリンクされています。多くの遺伝ベースのヒト疾患は、ギャップジャンクション遺伝子の変異にリンクされています。 SL-DT技術は、細胞の大集団におけるGJICの同時評価のためのシンプルな機能アッセイです。アッセイは、簡単に細胞集団を介して手術用メスの刃を有する細胞膜を摂動することによって蛍光色素でプレローディング細胞を含みます。蛍光色素は、その後、指定された時間のための隣接セルにギャップ結合チャネルを介して通過することを許可されています。アッセイは、その後、細胞にホルマリンを添加することによって終了されます。 FLUOの広がり細胞の集団を通じrescent染料は、落射蛍光顕微鏡で評価され、画像はパブリックドメインで検出されたフリーソフトウェアパッケージを含む利用可能である形態計測ソフトウェアパッケージ、任意の数を用いて分析されています。このアッセイはまた、処置された動物からの種々の臓器からの組織切片を用いたin vivo試験のために適応されています。全体的に、SL-DTアッセイは、in vitroでの薬理学的および毒物学的ニーズの広い範囲を提供することができ、潜在的に、より短い時間でより多くのサンプルを解明するために、自動化蛍光顕微鏡イメージングおよび解析の高スループットセットアップシステムに適合させることができます。
Introduction
この方法の全体的な目標は、化合物の潜在的毒性を評価するために、単純な包括的かつ比較的安価な技術を提供することにあります。これは、複数の細胞株において使用することができるインビトロアプローチです。落射蛍光顕微鏡を搭載した標準的な細胞生物学研究所は、このアッセイを使用して研究を行うことができます。
細胞機能の私達の基本的な知識は、in vitroバイオアッセイに大きく依存してきた、医薬品、環境汚染物質、食品生まれ汚染物質の毒性評価に不可欠な要素となっています。残念ながら、総合的にすべての毒性学的評価のための要求を満たすことができない単一のin vitroバイオアッセイ系はありません。 in vitroアッセイの多くは、特定の生化学的または分子のエンドポイントを評価するだけでなく、評価するために設計され、最適化されています。これらは、かなり頻繁に摂動を反映するように設定し、高スループットで結合されますそのような1シグナリングエストロゲン受容体などの特定のシグナル伝達経路、。この戦略は非常に成功しているが、遺伝子発現に関与するシグナル伝達経路の豊富な数は非常に複雑評価するために、特定のシグナル伝達経路を選択する作業を行います。ハイスループットプロトコルが現在開発と同時に、単一のアッセイのいくつかの制限を克服するための一つのアプローチをされている多数のシグナル伝達経路を測定するために使用されています。ただし、すべてのシグナル伝達経路が正常より包括的なアプローチに組み込まれている、プラス新しいシグナル伝達経路は、絶えずさらに、この評価プロセスを複雑にすることが発見されています。特に、高スループットシステム、in vitroでのアプローチの大規模な番号を使用して、総合的な毒性学的評価も非常に高価であり、ほとんどの単一の研究者につながらないための研究プロジェクトを主導しました。
GJICは、プロセスのtigですhtly膜と細胞骨格タンパク質2,3との主要な細胞内シグナル伝達経路との相互作用によって調節される電圧の変化、カルシウム濃度、pH、酸化還元バランスによって制御されます。したがって、GJICの阻害は、細胞ストレス、異なる細胞機能の破壊、または別のシグナル伝達経路の摂動の種類を反映することができます。制限されたシグナル伝達バイオアッセイの使用を克服するための別のアプローチは、多くの、そうでない場合は、ほとんどのシグナル伝達経路は、さらに、ギャップ結合チャネル4-8を介して協調細胞間シグナル伝達系によって調節されることが生物学的現象を利用することです。細胞間シグナル伝達系も多数あり、複数の経路の制御下にあるが、ギャップ結合チャネルを介したシグナル伝達間は、最終的には、部分的に閉じたまたは完全に閉鎖開かれているチャネルの機能です。これは、簡単に様々な使用して測定することができるエンドポイントを提供します試験管内バイオアッセイシステム7インチ組織の恒常性のセットポイントは、オープンチャネルが必要であることを考慮すると、ギャップジャンクション間コミュニケーション（GJIC）に対する化合物の効果を決定することは、化合物4,8の潜在的な毒性作用を決定する上で、より包括的なアプローチです。本質的には、遺伝子発現を制御する複数のシグナル伝達事象を調整において中心的役割を果たし、この重要な生物学的現象は、毒性作用の広範な評価を可能にします。したがって、GJICを評価するバイオアッセイは、化合物の毒性を評価するための優れた出発点です。
GJICを評価するために使用される最も広範な技術は、蛍光プローブで細胞をプレロードした後、隣接するセルにロードされた細胞または細胞からの染料の移行の監視に基づいています。染料をプリロードする技術は、プローブ11のロード10、およびメチルエステルをこすり、マイクロインジェクション9を含んでいました</suP>。メスローディング蛍光色素転写（SL-DT）メソッドは、かき取り負荷の変形例である-エルFouly 10によって開発された転移アッセイを染めます。むしろ、より侵襲的なこすりよりも、この報告書のメスローディング方法は、侵襲的な損傷を最小限に抑える細胞の単層を介して、丸刃（ 図1）とメスの穏やかなロールを伴います。この技術の利点は、細胞ではなく、マイクロインジェクションアッセイの単一細胞の集団の毒性学的評価です。さらに、このアッセイの単純さは、蛍光プローブのメチルエステルを使用するマイクロインジェクション技術及び技法を使用する方法が大幅に多くの時間がかかるのに対し、短時間で複数のプレートの迅速な検出を可能にし、かなり高いスキルレベルを必要とします。
GJICを研究するすべてのニーズを満たすために単一の方法がありませんが。 SL-DTアッセイができる簡単な、かなり安価で汎用性の高いアッセイであります様々な化合物の毒性の初期評価のためのニーズの多くを満たします。主な利点としては、単純さ、そのようなマイクロインジェクション、（FRAP）アッセイおよび分子蛍光プローブアッセイの局所的活性化を光退色後蛍光回復、大規模でGJICの迅速かつ同時評価などの他の方法に必要とされる機器やスキルの特別な必要性をin vivo試験のための自動化された蛍光顕微鏡イメージングおよび分析、ならびにその適応性と高スループットセットアップに資する細胞の数、。
Protocol
Representative Results
Discussion
SL-DTアッセイはGJICを測定する際の、シンプルで汎用性の高い手法であるが、適切な実験プロトコルを設計する際に考慮されるべきいくつかの重要な懸念があります。 SL-DTアッセイを用いてGJICの堅牢な測定のために細胞のギャップ結合を介して、LYの良い染料の広がりが存在しなければなりません。最低でも、十分な時間は色素が両方向でメス負荷細胞からの細胞の8行以上を介して拡散する?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIEHS grants #R01 ES013268-01A2, and the contents are solely the responsibility of the author and do not necessarily represent the official views of the NIEHS, and supported by CETOCOEN UPgrade project No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.
Materials
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3819–01 | |
| KH2PO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker – Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 mL conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system. | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| Image J | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
Referencias
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