Summary

Metodi per la determinazione dei tassi di glucosio e acidi grassi ossidazione nel cuore isolato di lavoro Rat

Published: September 28, 2016
doi:

Summary

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Abstract

Il cuore dei mammiferi è un grande consumatore di ATP e richiede un costante rifornimento di substrati energetici per la contrazione. Non sorprendentemente, alterazioni del metabolismo miocardico sono stati collegati allo sviluppo della disfunzione contrattile e insufficienza cardiaca. Pertanto, svelare il legame tra il metabolismo e la contrazione dovrebbe far luce su alcuni dei meccanismi che regolano l'adattamento cardiaca o disadattamento negli stati di malattia. Il lavoro di preparazione cuore isolato di ratto può essere utilizzata per seguire, contemporaneamente ed in tempo reale, la funzione contrattile cardiaca e flusso di energia fornire substrati in vie metaboliche ossidative. Il presente protocollo intende fornire una descrizione dettagliata dei metodi utilizzati per la preparazione e l'utilizzo di tamponi per la misurazione quantitativa dei tassi di ossidazione per glucosio e gli acidi grassi, l'energia principale fornendo substrati del cuore. I metodi utilizzati per l'analisi dei campioni e l'interpretazione dei dati vengono anche discussi.In breve, la tecnica si basa sulla fornitura di 14 C-glucosio radiomarcato e un acido grasso a catena lunga radiomarcato 3 H- al cuore ex vivo battere via normotermica perfusione cristalloide. 14 CO 2 e 3 H 2 O, sottoprodotti finali di le reazioni enzimatiche coinvolte nella utilizzazione di questi substrati energetici fornendo, vengono poi quantitativamente recuperati dall'effluente coronarica. Con la conoscenza della specifica attività dei substrati radiomarcati utilizzati, è quindi possibile quantificare singolarmente il flusso di glucosio e acido grasso nei percorsi di ossidazione. funzione contrattile del cuore isolato può essere determinato in parallelo con l'apparecchio di controllo appropriate e direttamente correlato ai valori flusso metabolico. La tecnica è estremamente utile per studiare il rapporto metabolismo / contrazione in risposta a varie condizioni di stress, come alterazioni nella pre e dopo carico e ischemia, un farmaco o un circulafattore ting, o alla alterazione dell'espressione di un prodotto genico.

Introduction

rilevanza clinica

Nel cuore dei mammiferi, vi è una forte relazione positiva tra il flusso dei substrati attraverso vie metaboliche ossidative, la produzione di ATP e il lavoro cardiaco 1. Nel corso degli ultimi due decenni, l'indagine del legame intricato tra il metabolismo e la funzione cardiaca ha portato a riconoscere che le alterazioni nel metabolismo cardiaco sono una causa per la disfunzione contrattile e forse patologico rimodellamento strutturale nel contesto di diversi tipi di malattie cardiache 2-4. Pertanto, si prevede che la nostra comprensione dei meccanismi che regolano rimodellamento metabolica del cuore sottolineato porterà alla identificazione di bersagli terapeutici per la prevenzione o il trattamento di insufficienza cardiaca 5-7. La recente pubblicazione di una dichiarazione scientifica della American Heart Association su "Valutare Cardiac Metabolism", sottolinea il crescente interesse della comunità scientifica per tsuo campo di ricerca 8. Ma mentre i progressi tecnologici nel campo dell'imaging cardiaco permettono ora per una valutazione rapida e accurata della morfologia e funzione cardiaca, lo studio in vivo del metabolismo cardiaco rimane limitata e gravoso: Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) e tomografia ad emissione di positroni (PET) può essere utilizzati per seguire cardiaca metabolismo del fosfato ad alta energia e l'attività ciclo di Krebs, ma queste tecniche sono afflitti da costi di gestione elevati e dalla loro incapacità di determinare il contributo di vari substrati al metabolismo ossidativo in condizioni di stato stazionario 9 .Per questa data l'ex vivo lavoro di preparazione cuore rappresenta la sola e unica tecnica a disposizione per studiare, simultaneamente e in tempo reale, funzione contrattile e del flusso dei substrati nelle vie metaboliche ossidative 7,9. Il seguente protocollo prefigge di fornire orientamenti nella preparazione e utilizzo di reagenti utilizzati per determinare il rattoes di utilizzo substrati, nel cuore isolato di ratto di lavoro.

L'isolato Apparato Cuore di lavoro per roditori

Anche se la tecnica è quasi mezzo secolo di vita, il lavoro di preparazione isolato cuore di ratto rimane un metodo di scelta per la ricerca cardiovascolare. Come per la preparazione del cuore Langendorff, cuore roditore lavoro offre un modo relativamente semplice, affidabile e poco costoso per misurare una vasta gamma di parametri cardiaci indipendentemente dagli effetti confondenti di altri organi, neurormonali e altri fattori circolanti. Ma a differenza cuore Langendorff-perfuso, cuore lavorando continua a svolgere lavoro cardiaco quasi fisiologica, un prerequisito per la generazione di flusso metabolico ossidativo a livelli che sono rilevanti per le condizioni in vivo. Ciò si ottiene fornendo il buffer perfusione del ventricolo sinistro (LV) attraverso una cannula collegata all'atrio sinistro, e come riempie e contratti LV, latampone viene espulso attraverso la linea aortica contro un post-carico determinata pressione idrostatica. Il design dell'apparato perfusione originariamente descritto da Neely e colleghi 10 è stato successivamente migliorato da Taegtmeyer, orli e Krebs 11, ma è cambiato molto poco da allora. Come descritto nel l'apparato originale, funzione contrattile può essere valutata attraverso la determinazione della gittata cardiaca, utilizzando non più di cilindri graduati e un cronometro per misurare aortica e coronarica flussi 10,11. Diversi fornitori offrono ora sistemi completi di roditori di lavoro del cuore di perfusione. Queste apparecchiature disponibili in commercio possono essere acquisite con flowprobes, trasduttori di pressione, un catetere pressione-volume e tutta l'attrezzatura necessaria per l'acquisizione dati funzionali cardiaca e analisi. I produttori forniscono ampie sessioni di documentazione e formazione per familiarizzare il nuovo utente con le loro attrezzature. Diversi articoli di revisione anche i protocolli di dettaglio sul strum cuore di lavoroentazione e l'uso di cateteri per misurare la funzione cardiaca nei roditori 12-15. Per questo motivo, ci sarà solo brevemente menzionare il set-up dell'apparato perfusione e l'apparecchio di controllo. Il presente protocollo piuttosto mira a completare le informazioni già disponibili con una descrizione dei metodi che possono essere implementate per misurare simultaneamente i tassi di glucosio e di catena lunga ossidazione degli acidi grassi, i due principali substrati energetici fornendo nel cuore normale. Descriviamo qui tutti i passi necessari per l'uso di substrati energetici radiomarcati per la valutazione del metabolismo ossidativo miocardica, dalla preparazione dei reagenti e tamponi per il recupero e l'elaborazione dei campioni, l'analisi dei dati.

Principi del metodo

Cardiomyocytes generano la maggior parte della loro energia per la contrazione della fosforilazione ossidativa degli acidi grassi (acidi grassi a lunga catena principalmente) e carboidrati (glucosE e lattato). Il cuore è molto limitato riserve energetiche e si basa su un costante rifornimento di questi substrati energetici fornendo dalla circolazione. Il catabolismo del glucosio attraverso la via glicolitica produce piruvato che viene poi decarbossilata dal piruvato deidrogenasi della membrana mitocondriale interna. Gli acidi grassi a catena lunga, estratti da albumina o lipoproteine ​​circolanti trigliceridi, vengono dapprima attivati ​​in molecole acil-CoA nel citosol e successivamente trasportati all'interno della matrice mitocondriale attraverso la navetta carnitina per entrare nel pathway beta-ossidazione. Le molecole acetil-CoA prodotti dal catabolismo di glucosio e acidi grassi alimentano il ciclo di Krebs per generare gli equivalenti riducenti (NADH e FADH2) che sono usati dalla catena di trasporto degli elettroni per costruire la forza proton-motrice attraverso la membrana mitocondriale interna e generare ATP attraverso l'attività di ATP sintasi. Acqua e biossido di carbonio sono i sottoprodotti finali dile reazioni enzimatiche che avvengono all'interno del ciclo di Krebs. La fornitura di 14 C e 3 H- substrati radiomarcati (ad esempio 14 glucosio C-radiomarcato e acido oleico 3 H-radiomarcato) al cuore lavorare isolato sarà di conseguenza portare alla produzione di 14 CO 2 e 3 H 2 O che può essere quantitativamente recuperato dall'effluente coronarica. La raccolta di 14 CO 2 viene effettuata mantenendo cuore isolato e perfuso in una camera sigillata e immediatamente recuperare l'effluente coronarica quando esce cuore. Una colonna piccola scambiatrice di anioni viene utilizzato per separare e recuperare 3 H 2 O dall'effluente coronarica. La radioattività dei campioni trattati viene misurata con un contatore a scintillazione liquida, e con la consapevolezza della specifica attività dei substrati radiomarcati utilizzato, è quindi possibile quantificare singolarmente il flusso di glucosio e acido grasso nelossidazione Percorsi di 16,17.

Protocol

NOTA: Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità alla politica NIH Public Health Service sulla cura uso umano e degli animali e sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali della University of Mississippi Medical Center. Tutte le procedure che prevedono l'uso di radioisotopi sono stati approvati ed eseguiti secondo le linee guida stabilite dall'Ufficio sicurezza delle radiazioni della University of Mississippi Medical Center. 1. P…

Representative Results

Due esperimenti di rappresentanza sono descritte nelle figure seguenti. In entrambi i casi, il cuore di 16 settimane di età maschio Sprague Dawley di ratto è stato isolato e perfuso in posizione di lavoro con tampone KH preparato secondo il protocollo precedente. In ogni esperimento, il cuore è stato sottoposto ad una condizione di stress di influenzare lavoro cardiaco. funzione contrattile cardiaca è stata valutata mediante registrazione continua della pressione differenziale attrav…

Discussion

Dettagli Il protocollo precedente i metodi per quantificare simultaneamente il flusso di substrato attraverso l'ossidazione del glucosio e ossidazione degli acidi grassi nel cuore isolato di ratto di lavoro. Le misurazioni possono essere sovrapposte ai parametri funzionali cardiaci registrati per determinare il rapporto tra substrati metabolismo e lavoro cardiaco in condizioni basali e di stress (variazione del carico di lavoro, ischemia-riperfusione, ecc …). E 'anche possibile valutare come il rappor…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Institutes of Health Grants R00 HL112952 (to R. H.), R01 HL108618 (to J.P.G.), P01 HL051971, and P20 GM104357. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

Materials

Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific BP358
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific P284
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) Fisher Scientific M63
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher Scientific S233
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670
AG 1-X8 resin, chloride form, 100-200 dry mesh size, 500 g Bio-Rad 1401441 This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form  (see reference below), but this will cost almost 8 times more
AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100-200 dry mesh size, 100 g Bio-Rad 1432445 Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol)
Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder Fisher Scientific 09-753-2
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318 Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage.
Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder Fisher Scientific 11-138B
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder EMD Millipore 820027 We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart.
Sodium Oleate Sigma-Aldrich O7501
Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- PerkinElmer NET289005MC Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling.
Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter Fisher Scientific 08-667E
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021
Glucose, D-[14C(U)]- PerkinElmer NEC042B005MC Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling.
Humulin R U-100 Eli Lilly and Company NDC 0002-8215-01 (HI-210)
Inactin Hydrate Sigma-Aldrich T133 Controlled substance on USDEA Schedule III
3-0 Silk Black Braid Roboz Surgical SUT-15-3
10X Hyamine Hydroxide PerkinElmer 6003005 Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage
20 mL Glass Scintillation Vials Fisher Scientific 03-341-25E Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2
20 mL HDPE Scintillation Vials Fisher Scientific 03-337-23B Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O
Red Rubber Sleeve Stoppers Fisher Scientific 14-126DD Fit 20 mL scintillation vials; Reusable
BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm BD 305194 Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap
Perchloric Acid, 60% Fisher Scientific A228 Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage
Ultima Gold, Scintillation Cocktail PerkinElmer 6013327
Glass Wool Fisher Scientific AC38606
Decon Dri-Clean Detergent Powder Fisher Scientific 04-355 For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing
Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent Fisher Scientific 16-000-115 For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue

Referencias

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Citar este artículo
Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart. J. Vis. Exp. (115), e54497, doi:10.3791/54497 (2016).

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