利用RNA测序来检测新剪接变异体在相关耐药<em>体外</em>癌症模型
Summary
这里，我们描述旨在调查异常剪接的耐药性在实体瘤和血液恶性肿瘤的影响的协议。为了这个目标，我们通过RNA测序分析，家长和体外抗车型的转录配置文件，并建立了定量RT-PCR为基础的方法来验证候选基因。
Abstract
抗药性仍然是癌症治疗为恶性血液病和实体瘤的一个主要问题。固有或获得性可通过多种机制，包括药物的消除增加引起的，药物吸收，药物失活和药物靶点的改变降低。最近的数据表明，除了通过公知的基因（突变，扩增）和表观遗传（DNA的甲基化，组蛋白的翻译后修饰）的修改，耐药机制也可能会被拼接像差调节。这是调查一个值得今后注意，以规划更加有效的治疗方法的迅速增长领域。在本文中描述的协议的目的是调查异常剪接的耐药性在实体瘤和恶性血液病的影响。为了这个目标，我们通过RNA测序和分析建立在体外模型几个转录概况ED一个定量RT-PCR为基础的方法来验证候选基因。特别是，我们评估DDX5和PKM转录物的差别剪接。由计算工具MATS检测出的异常剪接在白血病细胞进行了验证，显示出不同DDX5剪接变体是在亲代与抗性细胞中表达。在这些细胞中，我们也观察到了更高PKM2 / PKM1比，这未在的Panc-1抗吉西他滨的对应检测相比亲Panc-1细胞，这表明由吉西他滨诱导的曝光耐药的不同的机制。
Introduction
尽管在癌症治疗中，恶性细胞抗化疗，无论是本征或在长时间暴露于药物取得相当大的进展，是治疗失败的广泛白血病和实体瘤1的主要原因。
为了描绘耐药背后的机制， 在体外细胞系模型是由癌细胞对化疗药物抗性的逐步选择开发的。这个过程模仿临床设置中使用的制度，因此允许在有关耐药机制深入调查。其生存的治疗抗性细胞，然后从亲敏感细胞使用细胞生存力/细胞毒性试验2区分开。 在原代细胞的体外药物抗性型材已被证明是显著相关临床化疗反应3。
高通量cytotoxicity测定构成一种方便的方法，以确定在体外药物的敏感性。在此，细胞的存活率是通过评估实例的3- [4,5-二甲基-2-基] -2,5-二苯基四唑鎓溴化物- MTT法4，这是基于某些基材的代谢转化（即四唑盐）为有色产物，从而反映细胞的线粒体活性。可替代地，细胞蛋白质含量可以使用磺基罗丹明B（SRB）测定5来量化。这里，活细胞的数目正比于在分光光度计的适当波长测得的光密度（OD），不需要的 广泛而耗时的细胞计数的过程。通过一定的化疗药物诱导的生长抑制可以基于其中细胞用测试试剂处理，并用未处理的对照细胞的OD相比的孔的OD来计算。剂量反应曲线是OBTA通过绘制药物浓度对相对于对照细胞的活细胞的百分比INED。最后，药物敏感性可以报告相比，未经处理的细胞（IC 50），其导致细胞生长抑制50％的浓度。
耐药背后的机制包括许多不同的异常，如影响药物活性和细胞代谢的决定因素的基因表达的改变。这些分子的病变，包括突变，像差在转录和转录后水平以及干扰表观遗传调控往往影响或药物代谢或细胞凋亡6所涉及的基因。
替代前体mRNA剪接和它的复杂调控最近受到相当关注，因为这可能会决定癌细胞7耐药一种新型的实体。达人基因95％交替地在正常细胞通过此手段剪接紧紧从同一基因产生许多不同的蛋白质同种型调节的过程。选择性剪接经常失调在癌症和多种肿瘤都受到了越来越多的涉及药物代谢（ 即 ，脱氧胞苷激酶，叶酰聚谷氨酸合成酶，或者多药耐药蛋白）6,8-基因的改变的剪接特征。然而，耐药细胞的拼接型材综合分析是痛苦的缺乏。因此，当务之急是制定选择性剪接分析的高通量方法。这将有助于开发更有效的治疗方法。
在过去十年中，新一代测序（NGS）技术的快速发展，丰富了新的见解执政基因表达的调控以及它们在不同的生物过程9作用的分子机制的生物医学研究。 RNA的测序（RNA-SEQ）是一个功能强大的子应用程序在转录的字段NGS。它允许一个全基因组分析的数千同时基因的表达模式的（在质量和数量），是非常适合于新的编码mRNA的表征以及长的非编码RNA，miRNA的，siRNA的和其他小RNA类（ 如小核RNA和piRNA基因）10,11。
RNA测序已超过以往技术的转录组特征（ 例如，Sanger测序及表达微阵列）的许多优点。它不是基于现有基因组注释，它具有高分辨率的单核苷酸水平并且它有用于表达水平估计更宽的动态范围。简言之，将RNA测序实验的基本实验流程包括多聚腺苷酸转录（mRNA）的选择和碎片，然后转化成cDNA，图书馆建设，最后，大规模并行深度测序12,13。由于sequencin的快速下降在过去的几年中，RNA-SEQ G值正在逐步取代其他技术，并正在作出显著努力提高图书馆准备协议。例如，现在有可能通过标记用脱氧尿苷三磷酸（dUTP的）和之前，PCR扩增，消化与尿嘧啶DNA-glycosilase化酶（UDG）标记的链的第二链cDNA保留mRNA转录物的链信息。该方法增强了表达水平14,15的基因注释和估计的准确度。
分析和RNA测序数据的解读需要生物信息学管道16,17内的复杂和强大的计算软件包和处理。首先，原料读通过消除技术和生物文物和丢弃（切边），它没有达到严格的质量要求序列进行质量控制。接着各样品的读取映射到参考基因组和索引入基因级，外显子级，或转录级，以便确定每个类别的丰度。根据不同的应用，精制数据，然后通过统计模型进行等位基因特异性表达，剪接，基因融合和单核苷酸多态性（SNP）12的识别来计算。最后，在选定的水平（ 即，基因表达或剪接）的差分分析可以用来比较不同条件下获得的样品。
不同的剪接分析介绍了两个样本之间拼接网站使用的差异。越来越多的用于这一目的的软件包可以根据不同的统计模型，表演和用户接口18。其中，MATS（成绩单拼接的多因素分析）涌现作为基于贝叶斯统计框架免费提供的，精确的计算工具，旨在检测迪菲从单个或配对末端RNA测序数据rential剪接事件。从对齐（.bam）文件开始，MATS可以检测所有主要类型的选择性剪接事件（外显子跳跃，替代3'剪接位点，替代5'剪接位点，互斥的外显子和内含子保留-也参见图1）。
首先，软件识别读取支持一定剪接事件，例如外显子跳跃，并把它们分类成两种类型。 “夹杂读取”（用于规范剪接事件）映射调查外显子内，并且跨越该特定外显子和两个上游和下游侧翼的外显子之间的连接处。 “跳读”（用于选择性剪接事件）跨越两个侧翼外显子之间的交界处。随后，MATS返回纳入规范化水平为规范和替代的事件和样品或条件之间进行比较值。最终，它计算P值一第二假发现率（FDR）假设两个条件之间的基因的变体比率的差超过为每个拼接事件19,34给定的用户定义的阈值。
以下在用RNA-SEQ结合差别剪接分析，广泛的实验验证以鉴定真阳性候选基因18必要的。定量反转录聚合酶链式反应（QRT-PCR）是由RNA测序分析20获得候选验证最常用的和最佳的方法。本文的目的是提供一种完善的方法来调查在实体瘤和血液恶性肿瘤药耐药相关剪接轮廓。我们的方法利用了与耐药性有牵连的候选基因的验证建立定量RT-PCR方法相结合抗药性癌症的选择细胞系模型的RNA-SEQ基于转录组分析。
<p class ="“jove_content”">在本研究中所用的人白血病细胞系模型包括小儿T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞系CCRF-CEM（CEM-WT），它的两个糖皮质激素（GC）耐药的亚克隆CEM -C7H2-R5C3（CEM-C3）和CEM-C7R5（CEM-R 5）21,22和甲氨蝶呤（MTX）抗性亚系CEM / R30dm 23。虽然基于GC和MTX的当前疗法的情况下，约90％建立临床益处，GC-耐药性的出现仍然代表具有不明确的分子机理的未解决的问题。以分离抗性的GC-子克隆，CEM-WT细胞在1μM的地塞米松为2〜3周培养。 MTX抗性亚系CEM / R30dm通过反复短期（24小时）的CEM-WT细胞暴露于30μM的MTX作为模拟的临床方案开发的。有趣的是，该细胞系也显示塞米松交叉耐药（未发表的结果）的量，机制尚不完全清楚。固体TUM或模型在本研究调查的是胰腺导管腺癌，臭名昭著的非凡耐火度化疗。为此，我们选择的Panc-1细胞系和由连续孵育与药物24的1μM得到其耐吉西他子克隆的Panc-1R。在这里，我们描述了一种方法通过组合三个协议来发现在体外耐药底层新颖机制：比色细胞毒性试验，以评估在白血病细胞和实体瘤，RNA-SEQ基于管道癌细胞药物敏感性，以确定相关的新的剪接变体药物敏感性/抗性和RT-PCR和定量RT-PCR分析，以验证潜在候选。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里，我们介绍，结合成熟的细胞毒性筛选技术和功能强大的基于NGS-转录分析，以鉴别与耐药性差异剪接事件的新方法。分光光度测定法是方便和健壮高通量方法，以评估在体外癌症模型药物敏感性和代表第一选择许多实验室进行的细胞毒性筛查。故障诊断以及用于此方法的可能变化被广泛别处4,5-说明。
高通量基因组分析目前用于探索耐药机制主要依靠单核?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge prof. J.J. McGuire, prof. R. Kofler and dr. K. Quint for providing the resistant cell lines used in this work. The study has been founded by grants from Cancer Center Amsterdam (CCA) Foundation (to JC, EG and RS), the KiKa (Children Cancer-free grant for AW) foundation, the Law Offices of Peter G. Angelos Grant from the Mesothelioma Applied Research Foundation (to VEG and EG), Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Istituto Toscano Tumori (ITT), and Regione Toscana Bando FAS Salute (to EG).
Materials
| Sulforhodamine B | Sigma-Aldrich | 230162 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 251399 | |
| CCRF-CEM | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CCL-119 | |
| Panc-1 | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CRL-1469 | |
| DMEM high glucose | Lonza, Basel, Switzerland | 12-604F | |
| RPMI-1640 | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 11875093 | |
| Fetal bovine and calf serum | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 758093 | |
| penicillin G streptomycin sulphate | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 15140122 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| MTT formazan | Sigma Aldrich | M2003 | |
| Anthos-Elisa-reader 2001 | Labtec, Heerhugowaard, Netherlands | UV-Vis 96-well plate spectrophotometer | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Greiner/Sigma | M0812-100EA | |
| Trypsin/EDTA Solution 100 ml | Lonza, Basel, Switzerland | CC-5012 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82051-074 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82050-856 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) | B.Braun Melsungen AG, Germany | 362 3140 |
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