Usando RNA-sequenciação para detectar Novel Splice variantes relacionadas à resistência aos medicamentos em<em> In Vitro</em> modelos de cancro

Summary

Aqui nós descrevemos um protocolo teve como objetivo investigar o impacto do splicing aberrante na resistência aos medicamentos em tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. Para este objetivo, foram analisados os perfis transcriptomic de modelos parentais e resistentes in vitro através de RNA-seq e estabeleceu um método baseado qRT-PCR para validar genes candidatos.

Abstract

A resistência aos medicamentos continua a ser um grande problema no tratamento de câncer, tanto para doenças malignas hematológicas e tumores sólidos. resistência intrínseca ou adquirida pode ser causada por uma variedade de mecanismos, incluindo aumento da eliminação da droga, diminuição da absorção da droga, a inactivação de drogas e alterações de alvos de drogas. Dados recentes mostraram que diferente de pelo conhecido genética (mutação, amplificação) e modificações epigenéticas (hipermetilação DNA, histonas pós-translacional modificação), mecanismos de resistência a drogas também pode ser regulada por aberrações splicing. Este é um campo de rápido crescimento de investigação que merece atenção futuro, a fim de planejar abordagens terapêuticas mais eficazes. O protocolo descrito no presente trabalho tem como objetivo investigar o impacto de splicing aberrante na resistência aos medicamentos em tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. Para este objetivo, foram analisados os perfis transcriptomic de vários modelos in vitro através de RNA-seq e estabelecerEd um qRT-PCR baseado método para validar os genes candidatos. Em particular, foi avaliada a splicing diferencial da DDX5 e PKM transcrições. O splicing aberrante detectado pela ferramenta computacional PAD foi validado em células leucémicas, que mostra que diferentes variantes de splicing DDX5 são expressos nas células resistentes comparada parental. Nestas células, observaram-se também uma maior proporção PKM2 / PKM1, que não foi detectada na Panc-1 homólogo gemcitabina resistente em comparação com as células parentais Panc-1, sugerindo um mecanismo diferente de resistência à droga-induzida pela exposição a gemcitabina.

Introduction

Apesar dos avanços consideráveis no tratamento do cancro, a resistência de células malignas à quimioterapia, quer intrínseca ou adquirida após exposição prolongada da droga, é a principal razão para o insucesso do tratamento de uma vasta gama de leucemias e tumores sólidos ^1.

Para delinear os mecanismos subjacentes a resistência aos medicamentos, em modelos de linhas celulares in vitro são desenvolvidos por selecção gradual de células cancerosas resistentes a agentes quimioterapêuticos. Este procedimento imita os regimes utilizados nos ambientes clínicos e, portanto, permite a investigação aprofundada dos mecanismos de resistência relevantes. As células resistentes que sobrevivem ao tratamento, em seguida, são distinguidas das células parentais sensíveis usando ensaios de viabilidade celular / citotoxicidade ^2. Nos perfis de resistência a drogas in vitro de células primárias foram mostrados para ser significativamente relacionada com a resposta clínica à quimioterapia ^3.

cytoto de alto rendimentoensaios xicity constituem um método conveniente para determinar a sensibilidade de drogas in vitro. Nisto, a viabilidade das células é avaliada por, por exemplo, o ácido 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazólio – ensaio MTT ^4, o qual é baseado numa conversão metabólica de determinados substratos (isto é, sais de tetrazólio) em produtos coloridos, refletindo assim a atividade mitocondrial das células. Alternativamente, o teor de proteína celular pode ser quantificada utilizando o ensaio de sulforrodamina B (SRB) ^5. Aqui, o número de células viáveis ​​é proporcional à densidade óptica (DO) medida num comprimento de onda apropriado num espectrofotómetro, sem necessidade de extenso e procedimentos de contagem de células demorado. A inibição do crescimento induzida por um determinado fármaco quimioterapêutico pode ser calculado com base no diâmetro externo das cavidades em que as células foram tratadas com um agente de teste e comparado com o OD de células de controlo não tratadas. Uma curva de dose-resposta é obtainada representando graficamente as concentrações de fármaco, em função percentagens de células viáveis ​​em relação às células de controlo. Por fim, a sensibilidade ao fármaco pode ser avaliado como a concentração que resulta em 50% de inibição do crescimento de células, em comparação com células não tratadas _(IC50).

Os mecanismos subjacentes a resistência aos medicamentos incluem muitas anormalidades diferentes, tais como alterações que afectam a expressão do gene de determinantes de atividade de drogas e metabolismo celular. Estas lesões moleculares, incluindo mutações, aberrações em um nível transcricional e pós-transcricional, bem como regulação epigenética perturbado muitas vezes afetam genes envolvidos tanto no metabolismo de drogas ou apoptose ^6.

Alternative splicing de pré-mRNA e sua regulação intrincada recentemente recebeu atenção considerável como uma entidade romance que pode ditar a resistência aos medicamentos de células cancerosas ^7. Até 95% dos genes humanos estão alternativamente, dividida em células normais, por meio da presentebem regulado processo que produz muitas isoformas de proteínas diferentes do mesmo gene. O splicing alternativo é frequentemente desregulado no cancro e vários tumores são caracterizados por splicing alterada de um número cada vez maior de genes envolvidos no metabolismo do fármaco (isto é, desoxicitidina-quinase, folilpoliglutamato-sintetase, ou proteínas de resistência a múltiplas drogas) ^6,8. No entanto, uma análise abrangente de perfis de splicing de células resistentes aos medicamentos é dolorosamente falta. Portanto, é imperativo desenvolver métodos de alto rendimento para a análise de splicing alternativo. Isto poderia ajudar a desenvolver abordagens terapêuticas mais eficazes.

Durante a última década, o rápido desenvolvimento das tecnologias da próxima geração de sequenciamento (NGS) enriqueceu pesquisa biomédica com novos insights sobre os mecanismos moleculares que regulam a regulação da expressão do genoma e seu papel em vários processos biológicos ^9. ARN-sequenciação (ARN-SEQ), é um sub-potente aplicaçãoda NGS no campo da transcriptomics. Isso permite que um perfil de todo o genoma (tanto qualitativa como quantitativamente) dos padrões de milhares de genes simultaneamente expressão e é bem adequada para a caracterização de novos ARNm de codificação, bem como ARN de não codificação de comprimento, miARN, siRNA, e outra de ARN pequeno classes (eg, snRNA e Pirna) ^10,11.

RNA-Seq tem muitas vantagens em relação a tecnologias anteriores para a caracterização do transcriptoma (por exemplo, sequenciação de Sanger e microarranjos de expressão). Ele não se baseia no genoma anotação existente, que tem um nível de um único nucleótido de resolução e tem uma gama dinâmica mais ampla para a estimativa do nível de expressão. Resumidamente, o fluxo de trabalho experimental básico de experiências de ARN-SEQ consiste de transcrição selecção poliadenilado (ARNm) e fragmentação, seguido por conversão em ADNc, construção de biblioteca e sequenciação profunda finalmente, maciçamente paralelo ^12,13. Devido à rápida queda de sequencinCusta G ao longo dos últimos anos, o RNA-seq está gradualmente substituindo outras tecnologias e esforços significativos estão sendo feitos para melhorar os protocolos de preparação biblioteca. Por exemplo, é agora possível reter a informação de transcritos de ARNm de cadeia por marcação do segundo filamento de cDNA com o trifosfato de desoxiuridina (dUTP) e, antes da amplificação por PCR, digestão da cadeia marcada com uracilo-ADN-glycosilase (UDG). Este processo aumenta a precisão da estimativa de anotação do gene e dos níveis de expressão de ^14,15.

A análise e interpretação dos dados de RNA-seq exigem pacotes de software computacional complexas e poderosas e transformação no âmbito dos oleodutos de bioinformática ^16,17. Em primeiro lugar, a matéria-lê passam por um controle de qualidade através da remoção de artefatos técnicos e biológicos e descartando (corte) as sequências que não atingem os requisitos de qualidade rigorosos. Subsequentemente as leituras para cada amostra são mapeados para um genoma de referência e indexadosno gene de nível, de nível de exão, ou transcrição de nível, a fim de determinar a abundância de cada categoria. Dependendo da aplicação, os dados refinados são então calculado através de modelos estatísticos para a identificação de expressão alelo-específico, splicing alternativo, fusões de genes e polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ^12. Finalmente, a análise diferencial no nível seleccionado (isto é, expressão do gene ou de splicing alternativo) pode ser utilizado para comparar as amostras obtidas em condições diferentes.

análise de splicing diferencial descreve as diferenças no uso local de união entre duas amostras. Um número crescente de pacotes de software dedicados a este fim estão disponíveis com base em diferentes modelos estatísticos, performances e interface de usuário ^18. Entre estes, PAD (análise multivariada de Transcrição emenda) surge como uma ferramenta computacional disponível gratuitamente e precisa com base em um quadro estatístico Bayesian e projetado para detectar difeeventos de splicing rential de ambos os dados de ARN-SEQ finais simples ou emparelhadas. A partir dos arquivos alinhados (.bam), tapetes podem detectar todos os principais tipos de eventos alternativos de splicing (salto de exon, alternativa "local de splicing alternativo, 5 '3 local de união, exons mutuamente exclusivas e retenção de intron – também ver Figura 1).

Em primeiro lugar, os identifica software lê que suportam um determinado evento emenda, para pular exemplo exão, e classifica-os em dois tipos. "Inclusão lê" (para o evento emenda canônica) mapear dentro do exão investigado e abrangem as junções entre que exão específico e os dois exons que ladeiam a montante ea jusante. "Skipping lê" (para o evento de união alternativa) abrangem a junção entre os dois exons flanqueando. Posteriormente, MATS retorna o nível de inclusão normalizado para ambos os eventos canônicas e alternativos e compara valores entre amostras ou condições. Em última análise, ele calcula P-valor umnd taxa de descoberta de falsas (FDR), assumindo que a diferença na proporção variante de um gene entre duas condições exceder um limite definido pelo usuário dada para cada evento splicing ^19,34.

Após a análise de splicing diferencial em conjunto com ARN-SEQ, uma extensa validação experimental é garantido de modo a identificar genes candidatos verdadeiro-positivo ^18. Quantitativa reversa-reacção em cadeia da polimerase transcrito (qRT-PCR) é o método mais vulgarmente usado e óptimo em validação de candidatos obtidos a partir de análise de RNA-Seq ^20. O objetivo deste trabalho é fornecer uma metodologia sólida para investigar os perfis de emenda relacionados com resistência a drogas em tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. A nossa abordagem utiliza ARN-SEQ-base de perfis transcriptoma de modelos de linhas celulares seleccionadas de cancros resistentes a fármacos em combinação com um método de qRT-PCR estabelecido para a validação de genes candidatos envolvidos na resistência à droga.

<p class = "jove_content"> Os modelos de linhas celulares de leucemia humana usadas neste estudo incluiu-células T pediátrica leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) linha celular CCRF-CEM (CEM-WT), a dois de glucocorticóides (GC) -resistente subclones CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) e CEM-C7R5 (CEM-R5) ^21,22 e o metotrexato (MTX) sub-linha resistente à CEM / R30dm ^23. Embora as terapias actuais com base em GC e MTX estabelecer benefício clínico em cerca de 90% dos casos, o surgimento de GC-resistência ainda representa um problema não resolvido com um mecanismo molecular claro. Para isolar clones de sub-GC-resistentes, células CEM-wt foram cultivadas em 1 uM de dexametasona (Dex) durante 2 a 3 semanas. sublinha resistente-MTX CEM / R30dm foi desenvolvido por meio de curto prazo repetido (24 h) a exposição de células CEM-WT a 30 mM MTX como um imitador de protocolos clínicos. Curiosamente, esta linha celular também exibida resistência cruzada a Dex (resultados não publicados) para que o mecanismo não é completamente compreendido.

O tum sólidaou modelo investigado no presente estudo é o adenocarcinoma ductal pancreático, notório por sua extraordinária refractoriness à quimioterapia. Para este fim, foram selecionados linha Panc-1 de células e a sua sub-clone de gemcitabina-resistente Panc-1R obtido por incubação com 1 uM contínua do fármaco ^24. Aqui nós descrevemos uma abordagem para descobrir novos mecanismos subjacentes in-vitro resistência aos medicamentos através da combinação de três protocolos: ensaios de citotoxicidade colorimétricos para avaliar a sensibilidade de drogas em células leucêmicas e células cancerosas de tumores sólidos, gasoduto RNA-seq-base para identificar novas variantes de emenda relacionadas com sensibilidade ao fármaco / resistência e RT-PCR e análise de qRT-PCR para validar os potenciais candidatos.

Protocol

1. Caracterização de Perfis de resistência a medicamentos através de Citotoxicidade Cultura Linha de células leucémicas Manter a célula T parental toda a linha celular CCRF-CEM (CEM-WT), bem como as suas sublinhas resistentes a drogas, incluindo a CEM / R30dm, CEM-R5 e CEM-C3, em 25 cm2 em meio de 10 ml de RPMI-1640 contendo 2,3 uM de ácido fólico suplementado com 10% de soro fetal de vitelo e 100 unidades / ml de penicilina G e 100 ug / ml de estreptomicina. </li…

Representative Results

Os ensaios de citotoxicidade descritos no protocolo de proporcionar um método fiável e robusto para avaliar a resistência das células cancerosas a agentes quimioterapêuticos in vitro. Por meio do ensaio de MTT, sensibilidade a Dex foi determinada em quatro linhas T-ALL de células, incluindo células CEM-WT parentais @ Dex-sensíveis, e três sub-linhas resistentes à Dex: CEM / R30dm, CEM-R5 e CEM-C3. Duas faixas de concentração diferentes tinham de ser usados, devido à…

Discussion

Aqui nós descrevemos uma nova abordagem que combina técnicas de rastreio de citotoxicidade bem estabelecidos e poderosos transcriptomic baseado em NGS análises para identificar eventos de splicing diferencial em relação à resistência aos medicamentos. Ensaios espectrofotométricos são métodos de alto rendimento convenientes e robustos para avaliar a sensibilidade de drogas em modelos in vitro de câncer e representam a primeira escolha para muitos laboratórios que realizam exames de citotoxicidade. So…

Materials

Sulforhodamine B	Sigma-Aldrich	230162
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	251399
CCRF-CEM	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CCL-119
Panc-1	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CRL-1469
DMEM high glucose	Lonza, Basel, Switzerland	12-604F
RPMI-1640	Gibco, Carlsbad, CA, USA	11875093
Fetal bovine and calf serum	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	758093
penicillin G streptomycin sulphate	Gibco, Carlsbad, CA, USA	15140122
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Sigma Aldrich	252859
MTT formazan	Sigma Aldrich	M2003
Anthos-Elisa-reader 2001	Labtec, Heerhugowaard, Netherlands		UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Greiner/Sigma	M0812-100EA
Trypsin/EDTA Solution 100 ml	Lonza, Basel, Switzerland	CC-5012
CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82051-074
CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82050-856
Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%)	B.Braun Melsungen AG, Germany	362 3140