Zika Virus système infectieuse Culture cellulaire et la<em> In vitro</em> Effet prophylactique des interférons
Summary
Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.
Abstract
Zika Virus (ZIKV) est un pathogène émergent qui est lié à des anomalies du développement fœtal telles que la microcéphalie, des anomalies oculaires et troubles de la croissance. ZIKV est un virus à ARN de la famille des Flaviviridae. ZIKV est principalement transmis par les moustiques, mais peut aussi se propager par la mère à la transmission verticale du fœtus ainsi que le contact sexuel. À ce jour, il n'y a pas d'options de traitement ou de vaccin fiables pour protéger les personnes infectées par le virus. Le développement d'un système de culture cellulaire reproductible efficace du virus zika infectieux est essentielle pour l'étude des mécanismes moléculaires de la réplication de ZIKV ainsi que le développement de médicaments et de vaccins. À cet égard, un protocole décrivant un système in vitro Zika de culture de mammifère à base de cellules pour la production virale et de la croissance virale analyse est rapporté ici. Des détails sur la formation de plaques de virus zika sur une monocouche cellulaire et un essai sur plaque pour mesurer le titre viral sont présentés. génome viral cinétique de replicationet intermédiaires replicatory double brin du génome de l'ARN sont déterminées. Cette plate-forme de culture a été utilisée pour l'écran contre une bibliothèque d'une petite série de cytokines conduisant à l'identification de l'interféron-α (IFN-α), l'IFN-β et IFN-γ en tant que puissants inhibiteurs de la croissance virale Zika. En résumé, une maladie infectieuse système in vitro Zika virale de la culture et de diverses analyses virologiques sont démontrées dans cette étude, qui a le potentiel de grandement bénéficier la communauté des chercheurs à élucider davantage les mécanismes de la pathogenèse virale et l'évolution de la virulence virale. Antiviral IFN-alpha peut en outre être évalué en tant que post-exposition prophylactique, et l'option de traitement prophylactique des infections à virus Zika dans les populations à haut risque, y compris les femmes enceintes infectées.
Introduction
Zika Virus (ZIKV) est un agent pathogène humain important associé à une microcéphalie et une mauvaise issue de la grossesse 1,4. ZIKV appartient à l'ensemble des flavivirus médicalement pertinents qui peuvent causer des troubles neurologiques tels que la dengue, virus du Nil occidental, et les virus de l'encéphalite de Saint-Louis. Le principal mode de transmission du virus est par le moustique vecteur Aedes aegypti, et, en outre, la transmission sexuelle a également été rapporté 5,6. ZIKV est devenu un problème de santé mondial majeur en raison de la répartition géographique de l'expansion du moustique vecteur et de sa forte corrélation avec des malformations congénitales. ZIKV a été isolé en 1947 à partir d' un singe rhésus sentinelle dans la forêt Zika, l' Ouganda et le premier cas humain a été rapporté en 1952 7,8. Les personnes qui sont infectées par le ZIKV présent avec des symptômes bénins tels que la fièvre, des éruptions cutanées, des maux de tête, la conjonctivite, et les muscles / douleurs articulaires. Les femmes enceintes infectées peuvent transmettre ZIKV au fœtus en développement 1. ZL' infection de IKV a également été lié à un syndrome de Guillain-Barré, un nerf périphérique démyélinisation auto-immune trouble 9.
Le génome viral est constitué d'Zika un sens positif, une molécule d'ARN simple brin qui est à environ 10,8 kilobases de longueur. La structure du génome est organisé comme 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, avec des régions non codantes (NCR) flanquant une région codant pour la protéine 6. Un polyprotéine unique (3419 aa) est traduit qui est co- et post-traductionnelle clivé en 10 petits peptides. Tant le 5'NCR et 3'NCR ARN structures tige-boucle jouent un rôle crucial dans le début de la traduction du génome viral et la réplication. Les éléments de structure du génome sont constitués par des protéines de capside, la membrane et l'enveloppe. Les protéines non structurelles sont essentielles pour la replication du génome.
Actuellement, Zika souches virales sont regroupées en trois génotypes principaux: Afrique de l'Ouest, Afrique de l' Est et d' Asie 6,10-13. Il a été proposé que la lignée Afrique de l' Est se propager à l' Afrique de l' Ouest et de l' Asie, où il est ensuite plus évolué 12. Le génotype asiatique est responsable des flambées actuelles dans les Amériques. zika virus peut être cultivé dans les deux moustiques et les cellules de mammifères. Des fibroblastes primaires dermiques, les cellules dendritiques immatures, des cellules progénitrices neurales corticales, ainsi que les cellules Vero sont sensibles à une infection virale Zika 10,14,15. À la fois de type I et de type II , interférons ont été montrés pour limiter la croissance des ZIKV dans les fibroblastes de la peau 15. Les objectifs de cette étude sont de fournir, un protocole détaillé par étapes pour la production et l'analyse du génotype asiatique ZIKA souche virale PRVABC59 dans un système de culture de cellules de mammifères et de démontrer l'utilité de ce système de culture infectieuse comme une plate-forme de développement de médicaments. Cette ressource a le potentiel de grandement bénéficier la communauté de recherche virale et neurologique Zika à élucider imécanismes ts de la pathogenèse virale et de l'évolution de la virulence virale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, un protocole simplifié pour la culture de virus Zika in vitro est présenté. Les étapes critiques notamment, l'identification des points d'extrémité optimales pour l'expansion de la culture du virus, la mesure de titre, et la quantification de la réplication du génome ont été fournies. virus Zika est un agent pathogène humain, de sorte que, lors de la manipulation d'agents infectieux, les procédures de biosécurité doivent être strictement suivies. Une lignée de cellules de re…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red | Corning | 25-054-C1 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
| Countess – Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Countess-cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10283 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System | Thermo Fischer | 4471088 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| Vero Cell Line | ATCC | CCL-81 | |
| Zika viral strain PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| IL-1 alpha | Peprotech | 200-01A | |
| TNF-alpha | Peprotech | 300-01A | |
| Interferon alpha A | R & D Systems | 11100-1 | |
| Interferon beta | Peprotech | 300-02BC | |
| Interferon gamma | Peprotech | 300-02 | |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | 5415R | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810R | |
| Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |
Referencias
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