Massen Histologie zu Quantifizieren Neurodegenerative Erkrankungen in<em> Drosophila</em

Summary

Drosophila ist weithin als ein Modellsystem verwendet , Neurodegeneration zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, mit dem Degeneration, wie durch Vakuolenbildung im Gehirn bestimmt wird, kann quantifiziert werden. Es minimiert auch die Auswirkungen aufgrund der Versuchsdurchführung durch die Verarbeitung und sectioning Kontroll- und Versuchs Fliegen wie eine Probe.

Abstract

Progressive neurodegenerative Krankheiten wie Alzheimer-Krankheit (AD) oder Parkinson-Krankheit (PD) sind weltweit eine zunehmende Bedrohung für die menschliche Gesundheit. Obwohl Säugetiermodelle wichtige Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen der Pathogenität zur Verfügung gestellt haben, begrenzen die Komplexität von Säugetiersystemen zusammen mit ihren hohen Kosten ihre Verwendung. Daher stellt die einfache , aber gut etablierte Drosophila – Modell-System eine Alternative für die molekularen Mechanismen zu untersuchen , die bei diesen Erkrankungen betroffen sind. Neben Verhaltensdefizite sind neurodegenerative Erkrankungen, die durch histologische Phänotypen wie neuronaler Tod und Axonopathie charakterisiert. Um neuronale Degeneration zu quantifizieren und zu bestimmen, wie sie durch genetische und Umweltfaktoren beeinflusst wird, verwenden wir einen histologischen Ansatz, der auf die Messung der Vakuolen in erwachsenen Fliege Gehirn basiert. Um die Auswirkungen der systematischen Fehler minimieren und direkt vergleichen Abschnitte von Steuerung und experimental Fliegen in einem Präparat, verwenden wir den 'Kragen' Methode für Paraffinschnitten. Neurodegeneration wird dann durch Messen der Größe und / oder Anzahl der Vakuolen beurteilt, die in der Flug Gehirn entwickelt haben. Dies kann entweder durch die Konzentration auf eine bestimmte Region von Interesse durchgeführt werden oder durch das gesamte Gehirn Analyse von Serienschnitten zu erhalten, die den gesamten Kopf erstrecken. Daher ermöglicht dieses Verfahren nicht nur eine schwere Degeneration zu messen, sondern auch relativ mild Phänotypen, die nur nachweisbar in einigen Abschnitten sind, wie während der normalen Alterung auftritt.

Introduction

Mit der Zunahme der Lebenserwartung haben neurodegenerative Krankheiten wie Alzheimer oder Parkinson eine zunehmende Gesundheitsbedrohung für die allgemeine Bevölkerung geworden. Nach Angaben der National Institutes of Health, 115 Millionen Menschen weltweit sind voraussichtlich von Demenz im Jahr 2050 betroffen sein Obwohl erhebliche Fortschritte für viele von ihnen bei der Identifizierung von Genen und Risikofaktoren beteiligt in zumindest einige dieser Krankheiten gemacht worden, die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch nicht bekannt oder nicht gut verstanden.

Einfache invertebrate Modellorganismen wie Caenorhabditis elegans und Drosophila melanogaster bieten eine Vielzahl von experimentellen Vorteile , die Mechanismen von neurodegenerativen Erkrankungen zu untersuchen, einschließlich eines kurzen Lebenszyklus, eine große Anzahl von Nachkommen, und die Verfügbarkeit von gut etablierten und manchmal einzigartigen genetischen und molekularen Methoden ^{1 -12.} Weiterhin sind diese Organismen zugänglich unvoreingenommeneInteraktion Bildschirme, die Faktoren, die zu diesen Krankheiten, die durch ihre erschwerende oder lindernde Wirkung auf neurodegenerative Phänotypen identifizieren können.

Die Analyse solcher genetischer Interaktionen und Beurteilung Alterungseffekte erfordert quantitative Protokolle Neurodegeneration zu erkennen und deren Schweregrad zu messen. Diese Bewertung kann relativ einfach durchgeführt werden , wenn Verhaltensaspekte in Drosophila, wie olfaktorische Lernen, negativ geotaxis oder schnelle Phototaxis zu messen, die ^13-21 einen numerischen Leistungswert. Es ist auch möglich, die Wirkungen auf das neuronale Überleben durch Zählen Neuronen zu bestimmen. Dies ist jedoch nur möglich , wenn auf einer bestimmten Population konzentrieren , die eindeutig identifizierbar sind , wie die dopaminergen Neuronen, die bei Parkinson betroffen sind, und selbst dann waren die Ergebnisse umstritten ^22-24.

Das hier beschriebene Protokoll verwendet den Kragen Methode Paraffin Serienschnitte durchzuführen, ein Verfahrendas ursprünglich von Heisen und Böhl entwickelt, der es verwendet , um das Gehirn anatomisch Mutanten von Drosophila ²⁵ isolieren. Die Verwendung des Kragens Methode wurde anschließend angepasst, in Kryoschnitten einschließlich Vibratom Abschnitte und Kunststoffprofile ^26-28. Hier wird diese Methode Serienschnitte des gesamten Fliegenkopf zu erhalten , verwendet werden , die dann dazu verwendet werden kann , die Vakuolen zu messen , die ^16,21,29-32 in Fliegen mit neurodegenerative Phänotypen zu entwickeln. Diese Messungen können in bestimmten Gehirnbereichen durchgeführt werden oder kann das gesamte Gehirn bedecken; der letztere Ansatz ermöglicht es, selbst schwache degenerative Phänotypen zu identifizieren, da während des Alterns beobachtet. Wenn schließlich der Kragen verwendet wird, kann bis zu 20 Fliegen wie einer Zubereitung verarbeitet werden, die nicht nur weniger zeitaufwendig, sondern ermöglicht auch die Analyse von Kontroll- und experimentellen Fliegen in der gleichen Zubereitung, Artefakte aufgrund von geringen Änderungen minimiert in die Vorbereitung.

Protocol

1. Befestigung des Kopfes auf Krägen und Einbettung in Paraffin Hinweis: Alle Schritte in dem Fixierungsprozess sollte in einem Abzug durchgeführt werden. Methylbenzoat, während kein gesundheitliches Risiko darstellen, hat einen sehr deutlichen Geruch, die überwältigend sein kann, wenn nicht in einem Abzug behandelt. Bevor die Fliegen anesthetizing, bilden 50 ml Carnoy-Lösung durch Zugabe von 15 ml Chloroform und 5 ml Eisessig auf 30 ml 99% Ethanol (nicht das Chloroform mischen und Essigsäure)….

Representative Results

Mit Hilfe der beschriebenen Methode führt in Serienschnitten durch das Auge Pigment gefärbt 33, die das gesamte Fliegenkopf umfassen. Ein Teil davon ist in 1B gezeigt, wobei die Abschnitte von einem einzelnen Kopf von oben nach unten dargestellt. Die Abschnitte aus verschiedenen Fliegen werden in diesem Beispiel nach rechts gesehen links. Zur Orientierung und Identifizierung der Fliegen zu erleichtern, ein eyeless fly (sine oculis) als Marker an Pos…

Discussion

Das beschriebene Verfahren stellt ein Mittel Neurodegeneration im Gehirn von Drosophila zu quantifizieren. Während andere Methoden, wie einen spezifischen Zelltyp zu zählen, kann die Neurodegeneration zu identifizieren, verwendet werden, ist der Vorteil dieses Verfahrens, dass es im Allgemeinen angewendet werden kann. Zählen erfordert, dass Zellen können diese Zellen zuverlässig identifiziert werden unter Verwendung entweder eines spezifischen Antikörpers oder die Expression eines zellspezifischen Marker,…

Materials

Name of the Reagent/Equipment	Company	Catalog Number
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A discription to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made to fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor
Use in fume hood
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome	Leica Biosystems	Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide	Fisher Scientific Company	12-550D
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific Company	12-545-M
SafeClear	Fisher Scientific Company	314-629	Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover	Ted Pella Inc.	432-1
Permount	Fisher Scientific Company	SP15-500
Poly-L-lysine Solution	Sigma Life Science	P8290-500