に神経変性を定量化するために、マス組織学<em>ショウジョウバエ</em
Summary
ショウジョウバエは広く神経変性を研究するためのモデル系として使用されます。このプロトコルは、脳内の空胞の形成によって決定されるように、定量化可能な変性方法を記載しています。それはまた、一つのサンプルとして処理し、切片化対照および実験ハエによる実験手順に影響を最小限に抑えることができます。
Abstract
アルツハイマー病（AD）またはパーキンソン病（PD）などの進行性神経変性疾患は、世界中のヒトの健康に増加脅威です。哺乳動物のモデルは病原性の基礎となるメカニズムに重要な洞察を提供してきたが、一緒に高コストの哺乳動物系の複雑さは、その使用を制限しています。したがって、シンプルだが十分に確立されたショウジョウバエモデル・システムは、これらの疾患に影響される分子経路を調査するための代替手段を提供します。行動障害のほか、神経変性疾患は、神経細胞死と軸索障害などの組織学的表現型によって特徴付けられます。神経変性を定量化するために、それが遺伝的要因と環境要因によって影響される方法を決定するために、我々は大人のハエの脳内の空胞を測定することに基づいている組織学的アプローチを使用しています。系統誤差の影響を最小限に抑えるために、直接制御とEXPからの切片を比較します1つの製剤でerimentalハエは、我々はパラフィン切片のための「カラー」メソッドを使用します。神経変性は、その後、ハエの脳に開発した空胞のサイズ及び/又は数を測定することによって評価されます。これは、いずれかの特定の関心領域に焦点を合わせることによって、または完全長に及ぶ連続切片を得ることにより脳全体を分析することによって行うことができます。通常の老化時に起こるようなので、この方法は、1が厳しい変性だけでなく、いくつかのセクションにのみ検出され、比較的穏やかな表現型だけでなく、を測定することができます。
Introduction
平均余命の増加に伴い、アルツハイマー病やパーキンソンなどの神経変性疾患は、一般人口の増大する健康への脅威となっています。国立衛生研究所によると、115万人が世界中で、基礎となる重要な進歩は、それらの多くは、これらの疾患のうちの少なくともいくつかに関与する遺伝子および危険因子を同定することにしたが2050年に認知症により影響を受けると予測されます分子メカニズムはまだ不明かよく理解しています。
線虫（Caenorhabditis elegans）およびキイロショウジョウバエのような単純な無脊椎動物のモデル生物は、短いライフサイクル、子孫の数が多いと、十分に確立し、時にはユニークな遺伝的および分子的方法1の可用性を含む神経変性疾患のメカニズムを研究するための実験種々の利点を提供しています-12。さらに、これらの生物は、公平に適しています神経変性の表現型に対するそれらの悪化または改善効果によって、これらの疾患の要因を特定することができる相互作用の画面。
そのような遺伝的相互作用を分析し、高齢化の影響を評価することは神経変性を検出するために、その重症度を測定するための定量的なプロトコルが必要です。数値性能値13から21を提供するような嗅覚学習、負の走地性、または高速走光性ショウジョウバエにおける行動の側面を、測定するときにこの評価は、比較的容易に行うことができます。ニューロンを計数することによりニューロンの生存に対する効果を決定することも可能です。 PDに影響されるドーパミン作動性ニューロンのように、明確に識別可能である特定の集団に着目した場合ただし、これは可能であり、その後も、結果は22-24議論されています。
ここで説明するプロトコルは、パラフィン連続切片を実行するために、カラー方式を使用して、方法それは、もともとショウジョウバエ 25に解剖学的脳の突然変異体を単離するためにそれを使用しハイゼンベルクとBöhl、によって開発されました。カラー方法の使用は、その後凍結切片、ビブラトーム切片及びプラスチックセクション26-28に含むように適合されています。ここでは、この方法は、次に、神経変性表現型16,21,29-32とハエに開発空胞を測定することができる全体フライヘッドの連続切片を得るために使用されます。これらの測定は、特定の脳領域で行うことができ、または脳全体を覆うことができます。後者のアプローチは、老化中に観察されたように、1つは、弱い変性表現型を識別することができます。最後に、20ハエまで、カラーを使用している場合だけでなく、より少ない時間がかかるだけでなく、原因のわずかな変化にアーティファクトを最小化する、同じ製剤中に対照および実験ハエの分析を可能にする1つの製剤として処理することができます準備。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載された方法は、 ショウジョウバエの脳における神経変性を定量化する手段を提供します。他の方法は、特定の細胞型を計数するように、神経変性を同定するために使用することができるが、この方法の利点は、より一般的に適用できることです。細胞を計数することは、これらの細胞が確実に特異的な抗体や、常に利用可能でない細胞特異的マーカーの発現、のいずれかを用いて…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants to D.K. from the Medical Research Foundation of Oregon and from NIH/NINDS (NS047663). E.S. was supported by a training grant from the NIH (T32AG023477).
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | |
| Collar | Genesee Scientific | TS 48-100 | We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A discription to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html |
| Rubber ice cube tray for embedding | Household store | The size can be made to fit by glueing in additional walls | |
| Crystallizing dish | Fisher Scientific company | 08-762-3 | |
| Ether | Fisher Scientific Company | E138-1 | |
| Ethanol | Decon Laboratories Inc. | 2701 | |
| Choloroform | Fisher Scientific Company | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific Company | A38-212 | |
| Methylbenzoate | Fisher Scientific Company | M205-500 | Distinct Odor |
| Use in fume hood | |||
| Low Melting Point Paraffin Wax | Fisher Scientific Company | T565 | Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath |
| Microtome | Leica Biosystems | Reichert Jung 2040 Autocut | |
| Microscope Slide | Fisher Scientific Company | 12-550D | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific Company | 12-545-M | |
| SafeClear | Fisher Scientific Company | 314-629 | Three different containers for washes |
| Vertical Staining Jar with Cover | Ted Pella Inc. | 432-1 | |
| Permount | Fisher Scientific Company | SP15-500 | |
| Poly-L-lysine Solution | Sigma Life Science | P8290-500 |
Referencias
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer’s disease and other neurodegenerative diseases. Front Genet. 5, 279 (2014).
- Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).
- Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson’s disease, Alzheimer’s disease and autism spectrum disorder. Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).
- Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases. Chemistry Central Journal. 9, 65 (2015).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems. Hum Genet. 131, 535-563 (2012).
- Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila. Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).
- Konsolaki, M. Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila. Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).
- Kretzschmar, D. Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases. Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).
- Kretzschmar, D., et al. Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila. J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).
- Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).
- Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer’s disease. Mol Neurodegener. 8, (2013).
- Wentzell, J., Kretzschmar, D. Alzheimer’s disease and tauopathy studies in flies and worms. Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. , (2011).
- Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. J Vis Exp. , e50339 (2013).
- Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. , (2015).
- Iijima, K., et al. Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila. PLoS One. 3, e1703 (2008).
- Krishnan, N., et al. Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants. Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).
- Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).
- Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila. Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).
- Ping, Y., et al. Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer’s model. PLoS Genet. 11, e1005025 (2015).
- Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants. PLoS One. 10, e0145356 (2015).
- Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson’s disease in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).
- Navarro, J. A., et al. Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson’s disease in Drosophila. J Neurochem. 131, 369-382 (2014).
- Heisenberg, M., Böhl, K. Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means. Zeitschrift für Naturforschung C. 34, 143 (1979).
- Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. The Drosophila brain revisited by enhancer detection. J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).
- Lin, C. W., et al. Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome. J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).
- Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes. Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).
- Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3. J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).
- Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila. Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).
- Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration. PLoS One. 7, e44440 (2012).
- Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
- Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER. Hereditas. 46, 635-650 (1960).
- Bettencourt da Cruz, A., et al. Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila. Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).
- Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).
- Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).
- Davis, M. Y., et al. Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration. PLoS Genet. 12, e1005944 (2016).
- Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila. J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).
- Kretzschmar, D., et al. Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila. Glia. 49, 59-72 (2005).
- Li, Y., et al. A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).
