Betrouwbare identificatie van de levens- dopaminerge neuronen in de middenhersenen Cultures Met behulp van RNA Sequencing en TH-promotor-driven eGFP Expression
Summary
Bij de ziekte van Parkinson (PD), substantia nigra (SNC) dopaminerge neuronen degenereren, waardoor motorische stoornissen. Hier melden wij een protocol voor het kweken van ventrale middenhersenen neuronen van een muis tot expressie eGFP gedreven door een tyrosine hydroxylase (TH) promotor sequentie, het oogsten van individuele fluorescerende neuronen uit de culturen, en het meten van hun transcriptoom met behulp van RNA-seq.
Abstract
Bij de ziekte van Parkinson (PD) is wijdverbreid neuronaal verlies gehele hersenen met uitgesproken degeneratie van dopaminerge neuronen in de SNC waardoor bradykinesie, rigiditeit en tremor. De identificatie van levende dopaminerge neuronen in primaire ventrale mesencefale (VM) kweken met een fluorescente merker verschaft een alternatieve manier om de selectieve kwetsbaarheid van deze neuronen te bestuderen zonder te vertrouwen op de immunokleuring van gefixeerde cellen. Hier hebben we te isoleren, distantiëren en cultuur muis VM neuronen gedurende 3 weken. Vervolgens identificeren dopaminerge neuronen in de kweken met behulp eGFP fluorescentie (aangedreven door een tyrosine hydroxylase (TH) promoter). Individuele neuronen worden geoogst in microcentrifugebuizen met behulp van glas micropipetten. Vervolgens hebben we lyseren de geoogste cellen, en gedrag cDNA synthese en transposon-gemedieerde "tagmentation" om enkele cel RNA-Seq bibliotheken 1, 2 te produceren,ass = "xref"> 3, 4, 5. Na het passeren van een kwaliteitscontrole check, zijn eencellige bibliotheken gesequenced en de daaropvolgende analyse wordt uitgevoerd om de genexpressie te meten. rapporteren we transcriptoom resultaten voor de afzonderlijke dopaminerge en GABA-erge neuronen geïsoleerd van middenhersenen culturen. Wij rapporteren dat 100% van de levende TH-eGFP cellen die werden geoogst en gesequenced waren dopaminerge neuronen. Deze technieken zullen wijdverspreide toepassingen in de neurowetenschappen en moleculaire biologie.
Introduction
Ziekte van Parkinson (PD) is een ongeneeslijke, leeftijdsgebonden neurodegeneratieve aandoening. De oorzaak van deze relatief veel voorkomende aandoening blijft slecht begrepen. Er is wijdverbreid neuronaal verlies over de hersenen, met een uitgesproken neuronale degeneratie van dopaminerge neuronen in de substantia nigra (SNC) waardoor kenmerkende klinische kenmerken van bradykinesie, stijfheid en tremor.
Primaire gemengde kweken die SNc dopaminerge neuronen vooral relevant voor de ziekte van Parkinson. Ventrale tegmental Area (VTA) dopaminerge neuronen zijn betrokken bij beloning en verslaving. Ventrale mesencefale (VM) primaire gemengde embryonale culturen bevatten zowel SNc en VTA dopaminerge (DA) neuronen en GABA-erge neuronen. VM primaire kweken kan nuttig zijn voor neuroprotectie assays en de selectieve kwetsbaarheid van dopaminerge neuronen helderen. Er is geen betrouwbare manier om dopaminerge cellen in kweek op basis van morfologie te identificeren. Hijre ontwikkelen we technieken te identificeren en te oogsten enkele dopaminerge neuronen, en de bouw van single-cell, high-yield RNA sequencing bibliotheken.
Wij rapporteren representatieve RNA transcriptoom data voor alleenstaande dopaminerge en GABA-erge neuronen geïsoleerd van middenhersenen culturen. Dit protocol kan worden gebruikt voor neuroprotectie, neurodegeneratie en farmacologische assays om het effect van diverse behandelingen op de DA / GABA transcriptoom studie. Omdat dopaminerge neuronen vormen een kleine minderheid van de neuronen uitgedrukt in primaire kweken VM, zal het vermogen om deze neuronen in levende culturen betrouwbaar te identificeren een verbeterde reeks eencellige studies inschakelen. Deze nieuwe technieken zullen vooruitgang in het begrip van de mechanismen die plaatsvinden op cellulair niveau te vergemakkelijken en kunnen toepassingen elders op het gebied van neurowetenschappen en moleculaire biologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier isoleren we enkele cellen uit een heterogene populatie met behulp van een fluorescent label, dan studeren elke cel met single-cell RNA-seq. Wij rapporteren dat 100% van de levende TH-eGFP cellen die we geoogst en de sequentie inderdaad dopaminerge neuronen, gebaseerd op de aanwezigheid van de volgende drie DA-gerelateerde gen transcripten, TH, DDC en slc6a3. Alle TH-eGFP positieve cellen brachten deze drie genen zoals beoordeeld door RNA-Seq. Dit was overeenstemmend met elektrofysiologische studies waaruit bleek da…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), the Michael J. Fox Foundation, and the Caltech Innovation Initiative funding the Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory at the California Institute of Technology. We thank Brian Williams for optimising the RNA-Seq library protocol and for providing assistance. We thank Henry Amrhein for computational training. We thank Barbara J. Wold for the use of her equipment and laboratory space. We thank Igor Antoshechkin for library sequencing, and for facility management.
Materials
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 1X | Gibco | 14175-095 | |
| Donor Equine Serum | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM final concentration. |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50 X stock solution, 1 X final concentration. |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Stored at -20°C in 20 µL aliquots |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blue pipette tips | Sorenson Bioscience, | Inc. 10130 | |
| P1000 | |||
| 10 mm shallow Petri dish | VWR | 25384-324 | |
| 37°C Water bath | |||
| 37°C, 5% humidity incubator | |||
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Donkey serum | Equitech | SD-0100HI | 100% stock solution, 1% final concentration. |
| Standard Pattern surgical scissors | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps – 2×3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps – Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10X PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered solution (DPBS) 1X | Gibco | 14190-144 | 500 ml |
| 21 guage needle | BD PrecisionGlide Needle | 305167 | 100 needles |
| Micropipette puller | Sutter Instrument. | model P-87 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing | Clontech | 634936 | 100rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) | From the SMARTer Kit | ||
| Reverse transcriptase (100 units) | SMARTcribe reverse transcriptase | From the SMARTer Kit | |
| Primer 1 | 3’ CDSIIa primer | From the SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR primer | From the SMARTer Kit | |
| 50X 2 polymerase mix | 50X Advantage 2 polymerase mix | From the SMARTer Kit | |
| 10X PCR buffer | 10X Advantage 2 PCR buffer | From the SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR cooler rack | IsoFreeze PCR cooler rack. | ||
| DNA Sample Preparation Kit | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Samples |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | From the Nextera Kit | |
| PCR primer cocktail (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) | From the Nextera Kit | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110rxns |
| Electrophoresis system | Agilent 2100 Bioanalyzer. | G2938C | |
| Magnetic beads: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5ml |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500 assays |
| Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Glass capillary tubing | (Kimax-51, 1.5–1.8 mm o.d.) | ||
| Microforge | Narishige (or equivalent) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain | MMRRC stock number: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
Referencias
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
- Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
- Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
- Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
- Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).
