A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression
Summary
Na doença de Parkinson (PD), substância negra (SNC) neurónios dopaminérgicos degenerar, conduzindo a disfunção motora. Aqui nós relatamos um protocolo para a cultura de neurônios do mesencéfalo ventral de um ratinho expressando eGFP impulsionado por uma sequência de promotor de tirosina hidroxilase (TH), a colheita neurônios fluorescentes individuais das culturas, e medir o seu transcriptoma usando RNA-seq.
Abstract
Na doença de Parkinson (DP) não há perda neuronal generalizada em todo o cérebro com a degeneração dos neurónios dopaminérgicos pronunciada no Snc, levando a bradicinesia, rigidez e tremores. A identificação dos que vivem neurônios dopaminérgicos em culturas primárias Ventral mesencefálico (VM) usando um marcador fluorescente fornece uma forma alternativa para estudar a vulnerabilidade seletiva desses neurônios sem depender da imunocoloração das células fixas. Aqui, isolamos, dissociar e cultura rato neurônios VM para 3 semanas. Em seguida, identificar os neurónios dopaminérgicos em culturas usando eGFP fluorescência (conduzido por um promotor Tirosina Hidroxilase (TH)). neurónios individuais são colhidas em tubos de microcentrífuga utilizando micropipetas de vidro. A seguir, lisar as células colhidas, e realizar a síntese de cDNA e "tagmentation" mediada por transposão para produzir bibliotecas de ARN-Seq monocelulares 1, 2,ass = "xref"> 3, 4, 5. Depois de passar uma verificação de controlo de qualidade, as bibliotecas de uma única célula são sequenciados e subsequente análise é realizada para medir a expressão do gene. Nós relatamos resultados transcriptoma para dopaminérgico individual e neurônios GABAérgicos isolados a partir de culturas do mesencéfalo. Relata-se que 100% das células vivas TH-eGFP que foram colhidas e foram sequenciados os neurónios dopaminérgicos. Essas técnicas terão vastas aplicações em neurociência e biologia molecular.
Introduction
Doença de Parkinson (DP) é, uma doença neurodegenerativa incurável relacionada com a idade. A causa desta doença relativamente comum permanece mal compreendido. Há uma perda generalizada neuronal em todo o cérebro, com a degeneração neuronal acentuada de neurónios dopaminérgicos da substância negra (SNC), levando a características clínicas de diagnóstico de bradicinesia, rigidez e tremor.
culturas mistas primárias contendo neurônios dopaminérgicos SNc são especialmente relevantes para a doença de Parkinson. Ventral tegmental Área (VTA) neurônios dopaminérgicos têm sido implicados na recompensa e vício. Ventral mesencefálico (VM) culturas embrionárias mistos primários contêm ambos os neurônios SNC ou a VTA dopaminérgico (DA) e neurônios GABAérgicos. VM culturas primárias podem ser úteis para ensaios de neuroproteção e para elucidar a vulnerabilidade selectiva dos neurónios dopaminérgicos. Não há nenhuma maneira confiável para identificar células dopaminérgicas na cultura com base na morfologia. Elere desenvolvemos técnicas para identificar e colher neurónios dopaminérgicos individuais e construir uma única célula, de alto rendimento bibliotecas RNA sequenciamento.
Relatamos dados RNA transcriptoma representativos para única dopaminérgica e neurônios GABAérgicos isolados a partir de culturas do mesencéfalo. Este protocolo pode ser utilizado para a neuroprotecção, a neurodegeneração, e os ensaios farmacológicos para estudar os efeitos de vários tratamentos no transcriptoma DA / GABA. Porque neurônios dopaminérgicos representam uma pequena minoria dos neurônios expressas em culturas primárias de VM, a capacidade de identificar com segurança esses neurônios em culturas que vivem permitirá uma gama avançada de estudos de uma única célula. Essas técnicas inovadoras facilitar avanços na compreensão dos mecanismos que ocorrem no nível celular e pode ter aplicações em outros lugares nos campos da biologia molecular e neuroscience.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós isolar células individuais de uma população heterogênea, utilizando uma etiqueta fluorescente, em seguida, estudar cada célula com uma única célula de RNA-seq. Relata-se que 100% das células vivas TH-eGFP que colhidas e foram sequenciados os neurónios dopaminérgicos, de facto, com base na presença dos três transcritos de genes relacionados com DA seguintes, TH, DDC e SLC6A3. Todas as células positivas TH-EGFP expressa estes três genes como avaliado pela RNA-Seq. Este foi concordante com os estudo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), the Michael J. Fox Foundation, and the Caltech Innovation Initiative funding the Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory at the California Institute of Technology. We thank Brian Williams for optimising the RNA-Seq library protocol and for providing assistance. We thank Henry Amrhein for computational training. We thank Barbara J. Wold for the use of her equipment and laboratory space. We thank Igor Antoshechkin for library sequencing, and for facility management.
Materials
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 1X | Gibco | 14175-095 | |
| Donor Equine Serum | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM final concentration. |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50 X stock solution, 1 X final concentration. |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Stored at -20°C in 20 µL aliquots |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blue pipette tips | Sorenson Bioscience, | Inc. 10130 | |
| P1000 | |||
| 10 mm shallow Petri dish | VWR | 25384-324 | |
| 37°C Water bath | |||
| 37°C, 5% humidity incubator | |||
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Donkey serum | Equitech | SD-0100HI | 100% stock solution, 1% final concentration. |
| Standard Pattern surgical scissors | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps – 2×3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps – Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10X PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered solution (DPBS) 1X | Gibco | 14190-144 | 500 ml |
| 21 guage needle | BD PrecisionGlide Needle | 305167 | 100 needles |
| Micropipette puller | Sutter Instrument. | model P-87 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing | Clontech | 634936 | 100rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) | From the SMARTer Kit | ||
| Reverse transcriptase (100 units) | SMARTcribe reverse transcriptase | From the SMARTer Kit | |
| Primer 1 | 3’ CDSIIa primer | From the SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR primer | From the SMARTer Kit | |
| 50X 2 polymerase mix | 50X Advantage 2 polymerase mix | From the SMARTer Kit | |
| 10X PCR buffer | 10X Advantage 2 PCR buffer | From the SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR cooler rack | IsoFreeze PCR cooler rack. | ||
| DNA Sample Preparation Kit | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Samples |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | From the Nextera Kit | |
| PCR primer cocktail (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) | From the Nextera Kit | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110rxns |
| Electrophoresis system | Agilent 2100 Bioanalyzer. | G2938C | |
| Magnetic beads: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5ml |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500 assays |
| Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Glass capillary tubing | (Kimax-51, 1.5–1.8 mm o.d.) | ||
| Microforge | Narishige (or equivalent) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain | MMRRC stock number: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
Referencias
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
- Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
- Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
- Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
- Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).
