Dit protocol beschrijft de intravital beeldvorming van transgene muizen uiting van cel-specifieke fluorescente markeringen. Intravital imaging biedt een niet-invasieve methode voor hoge resolutie waarnemingen in levende dieren met behulp van implanteerbare windows waardoor de microscopische visualisatie van de processen mogelijk is. Deze methode is vooral handig om longitudinale processen te bestuderen.
Tumor en tumor vaartuig ontwikkeling, evenals de tumor reactie op therapeutiek, zijn hoogdynamische biologische processen. Histologie statische informatie en is vaak niet voldoende voor een correcte interpretatie. Intravital evaluatie, waarin een proces wordt gevolgd in de tijd, worden extra en vaak onverwachte informatie. Met de oprichting van transgene dieren uiting van cel-specifieke markers en levende cel verklikstoffen, verbeteringen aan beeldvormende apparatuur en de ontwikkeling van verschillende beeldvormende kamers, intravital microscopie is uitgegroeid tot een belangrijk instrument om beter te begrijpen biologische processen. Dit witboek beschrijft een proefopzet voor het onderzoek van tumor vaartuig ontwikkeling en therapeutische effecten in een ruimtelijke en temporele wijze. Met behulp van dit setup, worden de fase van het vaartuig ontwikkeling, vorming van tip-cel en lumen, doorbloeding, extravasation, een gevestigde vasculaire bed en vasculaire vernietiging gevisualiseerd en gevolgd. Therapeutische effecten, intratumoral het gedrag en de lokalisatie van chemotherapeutische stoffen kunnen bovendien ook worden gevolgd.
In vitro studies kunnen weliswaar high-resolution kinetische beeldvorming van processen, in vitro experimenten evaluatie in de juiste context niet ingeschakeld. Bijvoorbeeld, kan niet de interactie van tumorcellen met stromale compartimenten of drug delivery en distributie binnen een tumor bestudeerd worden in een plaat van de cultuur. Dierlijke modellen worden daarom gebruikt om na te bootsen de menselijke fysiologie en pathologie. Echter is de longitudinale beeldvorming van processen, met name bij een subcellular resolutie uitdagend. Moleculaire beeldvorming methoden, zoals magnetische resonantie beeldvorming (MRI), single-photon emission berekend tomografie (SPECT) en positron emissie tomografie (PET), hebben goede doordringing diepten maar onvoldoende resolutie of falen om te illustreren van anatomische structuren. Optische beeldvorming biedt hoge resolutie en maakt de beeldvorming van structuren, maar het vergezeld gaat van armen minimale penetratie1. De toepassing van intravital microscopie in combinatie met venster kamer technologieën, zoals een dorsale huidplooien of abdominale venster, zorgt voor hoge resolutie beeldvormende in vivo2,3,4. Deze technologie heeft duidelijke voordelen, omdat het zorgt voor longitudinale beeldvorming over uren en zelfs dagen, voor beeldvorming van processen in de juiste context (bijvoorbeeld cel-cel-interacties in de verbeelde weefsel), en resoluties op de optische grenzen van geavanceerde confocale en multiphoton microscopen.
De invoering van transgene dieren met cel – of eiwit-specifieke fluorescerende labels opent een overvloed aan mogelijkheden voor in vivo es ex vivo experimenten. Voor aanleg, cel-cel interacties, de productie van eiwitten en het antwoord op manipulatie of therapie kunnen bestudeerd worden modellen in vivo met behulp van deze5,6,7,8. Nog belangrijker is, plaatst u plaats en tijd kunnen worden bepaald met de juiste beeldvormende apparatuur en methodologie. Hier, de intravital microscopie van dieren uiting van een endothelial marker in combinatie met injecteerbare agenten in een tumor geïmplanteerd in een gemodificeerde dorsale huidplooien venster kamer wordt gepresenteerd.
Als de tumor en de tumor vaartuig ontwikkeling, alsmede de therapeutische effecten van de tumor, hoogst dynamische processen zijn, is intravital evaluatie een elegante hulpmiddel te maken van een juiste beoordeling van deze processen in een tijd – en ruimtelijke-afhankelijke manier. Met de toenemende beschikbaarheid van levende cellen markeringen, de oprichting van transgene dieren en de vooruitgang van beeldvormende modaliteiten, wordt intravital imaging steeds meer en meer populair. Hoewel histologie nog steeds regelmatig gebruikt is en een veelheid van markeringen kan worden gebruikt voor het identificeren van de cellen en structuren, heeft weefsel afdelen nadelen bij het onderzoeken van dynamische processen. Weefsel dissectie is vereist, alleen statische informatie; fixatie is van invloed op de kwaliteit van het weefsel; en snijden schade cellulaire interacties. Ook bij het onderzoeken van dynamische processen, nodig weefsel dissectie op verschillende en vaak vermoedelijke, tijd-punten een grote hoeveelheid dieren. Met de beeldvorming van het intravital, kunnen de XYZ ruimtelijke dimensies en de extra dimensie van tijd worden geëvalueerd in hetzelfde dier, waardoor de juiste positionering van de verschillende spelers in ruimte en tijd. Daarom optimale tijdstippen zijn niet gemist, en het dier dat wordt gebruikt per experiment is aanzienlijk verminderd. Ten tweede, het tijd-venster met intravital evaluatie tot stand gebracht kan worden geëxtrapoleerd optimaliseren van weefsel extractie. Ten derde, de gewenste fase van de groei van het schip intravitally geïdentificeerd en gekleurd als geheel-mount weefsel.
Het intravital ontwerp vermeld in dit manuscript gebruikt een combinatie van transgene dieren uiting geven aan een fluorescerende label in de endotheliale cellen, een gewijzigde dorsale huidplooien kamer model, en een speciale multiphoton-confocal microscoop.
Endotheliale cellen doorlopen in een aantal fasen21,22 tijdens angiogenese en deze fasen kunnen vaak tegelijkertijd worden gezien in een tumor. Met behulp van de eNOSTag-GFP muis lijn, afzonderlijke endotheliale cellen kunnen worden gevolgd, en zelfs filopodia dynamics kunnen worden getraceerd. Het is daarom een goed model te bestuderen vaartuig ontwikkeling intravitally. Afhankelijk van de al-heden intrinsieke etiketten, kunnen injecteerbare fluorescerende stoffen worden gebruikt ter beoordeling van lumen vorming, doorbloeding, extravasation en bloed goedkeuring. De muis is continu beeld voor maximaal 5 h. De lange termijn evaluatie van een dier is haalbaar wanneer verschillende voorzorgsmaatregelen met betrekking tot de verdoving van het dier worden genomen, die al eerder beschreven23. Als dit onderzoek zich op kanker richt, werden tumoren weefsels of cellen geïmplanteerd. Echter, wij ook geëxperimenteerd met de middenvoetsbeenderen en embryonale longen. Echter, het groeitempo op jaarbasis van weefsel onder studie is beperken, zoals na een paar weken, de huid begint te regrow, die kan worden een probleem met traag groeiende tumoren of weefsels.
Tijdens de valideringsfase de dorsale die huidplooien venster kamer was aanzienlijk gewijzigd ten opzichte van het klassieke model4. De frames worden geconstrueerd van autoclaaf synthetisch materiaal en zijn licht en klein, met een groot venster-weergavegebied. De haak van de borgring (figuur 1Bg, witte pijlpunt) wordt alleen gebruikt voor het eenvoudig verwijderen van de ring. Vazal ringen zonder haken kunnen worden gebruikt wanneer dit met beeldvorming mengen. De huid is niet te veel, uitgerekt losraken treedt niet op in dit model, en infecties worden slechts zelden gezien. Deze wijzigingen verminderen dier ongemak en verfijnen van de dierlijke procedure aanzienlijk. Ook kunnen de metalen delen gemakkelijk worden verwijderd wanneer de tumor met behulp van MRI24imaging.
Een microscoop kan worden aangenomen op intravitally afbeelding dorsale huidplooien kamers. De belangrijkste vereiste is de beschikbare ruimte tussen het podium van de Microscoop en het objectief. Een belangrijk aspect buikvliesontsteking imaging is beweging. Om te voorkomen dat artefacten van de beweging, moet een platform dat past in de tabel van de Microscoop (na de verwijdering van alle inserts) en ondersteunt de muis worden gebruikt. Het is niet nodig te bedwingen van de muis wanneer het onder verdoving, en is het beter om de muis adem vrij laat. Echter is het venster vastgeschroefd op het platform, waardoor optimale fixatie van het gezichtsveld (dat wil zeggen, de tumor is zichtbaar door het venster kamer). Het platform wordt verwarmd met behulp van een elektronische verwarming pad, zoals gebruikt voor dierlijke Verwarming. Dit platform werd intern, en specificaties kunnen verkregen worden op aanvraag. Een hoge resolutie objectief is een noodzaak bij de beoordeling van de intracellulaire processen en maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen het cytoplasma en de kern. Het gebruik van een taps toelopende lens met een goede optische resolutie (hoge nvt) maar een relatief lange afstand (bij voorkeur 2 mm of hoger) wordt aanbevolen. De beperking in de beeldvorming is de indringingsdiepte en de fluorescerende intensiteit van de etiketten. Bovendien, photobleaching, fototoxiciteit en verzadiging moeten worden vermeden tijdens de beeldvorming.
Hier, werden een geïntegreerde confocal-multiphoton en een confocal microscoop gebruikt. De multiphoton is rechtop, terwijl de confocal een omgekeerde Microscoop is. Het voordeel van een rechtop Microscoop is het gemakkelijk gebruik van water-onderdompeling lenzen. Deze lenzen hebben een hoge nb en een lange afstand, zelfs bij een vergroting van de hoge (bijvoorbeeld 20 of 40 X). Specifiek, is het aanbevolen om het verkrijgen van een 20 X nb 1.0 water-onderdompeling lens, die wordt verkocht door diverse bedrijven. Weet dat wanneer immersie-lenzen worden gebruikt, het objectief en de immersie vloeistof moeten worden verwarmd tot 37 ° C. Voor de beste beelden, het is aanbevolen om optimale confocal instellingen gebruiken (dat wil zeggen, gaatje op 1 luchtige unit, laser macht zo laag als mogelijk, winst niet te hoog (vooral als de winst introduceert ruis), lijnsnelheid op maximum, en geen gemiddeld van scans). Overbelichting, verzadiging, en het verschil in intensiteit tussen afbeeldingen compromis kwaliteit van de gegevens. Het is raadzaam om verzadiging en overbelichting te voorkomen. Dit kan worden omzeild door de afbeeldingen op verschillende winst instellingen ophalen. Het veranderen van de winst is de gemakkelijkste manier om de helderheid van de afbeelding te wijzigen. Indien nodig, kan de kracht van de laser kan worden ingesteld. Om de beeldkwaliteit te standaardiseren, kunnen dia’s met een vaste fluorescentie intensiteit worden gebruikt. Men moet houden in het achterhoofd dat zelfs wanneer de Microscoop is optimaal ingesteld, beeldkwaliteit wordt bepaald voor een groot deel door de kwaliteit van de kamer van het venster en weefsel
Wanneer u scant meerdere fluorescente markeringen gelijktijdig, moet bloeden-through, waarin een fluorophore wordt aangetroffen in het kanaal van een andere, worden vermeden. Vermijd bloeden-door met behulp van een combinatie van fluorophores met minimale overlappende spectra en sequentiële scannen tussen frames. De beelden die hier gepresenteerd werden gescand met behulp van 3 sequentiële scans (Track 1: GFP, DID of fluor647 met de 488 en 633 laser; spoor 2: rhodamine, Doxil of mTomato met de 543 laser; en 3 bijhouden: Hoechst met de 405 laser).
De mogelijkheid van de evaluatie van de verschillende stadia van tumor vaartuig ontwikkeling, tip cel dynamics lumen vorming, extravasation en vasculaire schade wordt hier weergegeven. Met behulp van de eNOStag-GFP-lijn, worden tumor gebieden met een verwoeste vasculaire bed gemakkelijk gedetecteerd door gekorrelde cellulaire restjes nog GFP uitdrukken. Geen injecteerbare agent werd ontdekt in deze gebieden, met vermelding van het gebrek aan stroom. Dit betekent dat beheerd chemotherapeutische agenten zullen deze gebieden ofwel niet bereiken. Vernietiging van het schip kunnen echter ook een therapeutische resultaat. Pre beoordeling van de tumor, om te controleren voor voorbehandeling vaartuig vernietiging, is een voorwaarde voor de nauwkeurige therapeutische evaluatie en gemakkelijk kan worden uitgevoerd met behulp van deze proefopzet.
Er is een overvloed aan mogelijkheden waarvoor intravital microscopie kan worden gebruikt, en gedetailleerde discussie valt buiten het bestek van deze publicatie. Een korte om inzicht te geven, omvatten mogelijke toepassingen studies betreffende de accumulatie van chemotherapeutica in tumor weefsel, de ontwikkeling van schepen (bijvoorbeeld het aantal vaartuigen, takken en kruispunten) en doorbloeding, cel-cel interacties, cel richt, en intracellulaire verwerking, alsmede voorbeelden hierboven en hieronder. Als de analyse is gebaseerd op fluorescentie, zich bewust zijn van intensiteit schommelingen als gevolg van de kwaliteit van het venster of weefsel. Zoals tumor weefsel relatief dik is, fluorescentie van boven of onder het vlak van weergave heeft ook een invloed op het signaal in de afbeelding. Het is best om de kwantitatieve beeldanalyse combineren met objectieve metingen. Bijvoorbeeld, indien u interesse hebt in een concentratie die drug, de tumor weefsel te verwijderen uit het venster na intravital microscopie en bepalen van de inhoud te vergelijken met de confocal beelden met HPLC met drug.
De evaluatie van de reactie van de tumor kan worden uitgevoerd als goed met behulp van dit model, maar met enkele voorzorgsmaatregelen. Men moet realiseren dat tumoren ook naar binnen, in de huid groeien. 3D-metingen kunnen worden gemaakt als de penetratie diep genoeg is ter dekking van de hele tumor. In dat geval moeten far-red kleurstoffen worden gebruikt. Het venster kamer als beschreven hier aanbiedingen met tumoren in de omgeving van een huid, en het is belangrijk erop te wijzen dat het venster een temperatuur iets lager dan de lichaamstemperatuur van de normale muis handhaaft. Daarom is het beste om te studeren van tumoren in de juiste micro milieu instelling te bevestigen intravital studies met de dorsale huidplooien venster kamer. Nog belangrijker is, de dorsale huidplooien kamer biedt inzicht in de kinetiek van processen en mechanismen, een instrumentale basis te verschaffen voor de verbetering van de therapie. Ook kan extra informatie over de ook en farmacokinetiek worden verkregen. Klassiek, zijn deze ook studies uitgevoerd door behandeling van tumor-dragende dieren en ontrafeling van tumoren/organen voor het meten van de drug opname. Met behulp van dit intravital model, kan de locatie van de intratumoral van een drug (dat wil zeggen, intravasculaire, intratumoral, intracellulaire of nucleaire) worden verstrekt2625,5,. Niet alleen is de locatie van de drug geopenbaard, maar ook de tijd venster-van-kansen voor de meest optimale opname.
Met behulp van de proefopzet in dit artikel beschreven, kan een groot aantal parameters worden geëvalueerd in een temporele en ruimtelijke omgeving. In het bijzonder hier laten we zien dat intravital microscopie biedt belangrijke inzichten in de dynamiek van tumor vaartuig ontwikkeling en therapeutische respons.
The authors have nothing to disclose.
We zouden graag bedank Rien van Haperen en Rini de Crom voor hun ontwikkeling en de donatie van de eNOSTag-GFP-lijn, Joost A.P. Rens voor zijn technische hulp bij het dierlijke werk, en de dieren hun begeleiders voor hun hulp. De microscopie installaties maken deel uit van het Erasmus optische Imaging Center, en wij willen de medewerkers van de OIC voor hun dienst bedanken. Deze studie werd ondersteund door DDHK 2000-2224 subsidie van de Nederlandse Cancer Society “Vereniging Trustfonds” Erasmus Universiteit Rotterdam en de “Stichting Erasmus Heelkundig Kankeronderzoek”, en wij danken de leden van de commissies voor hun gulle donatie.
DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
PBS | |||
Window frames | Costum made | ||
Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
Eye ointment | |||
Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
0.9% NaCl | |||
Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
Window holder | Costum made | ||
tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
LAS AF Software | Leica |