Este protocolo describe la imagen intravital de ratones transgénicos que expresaban marcadores fluorescentes específicos de la célula. La proyección de imagen intravital proporciona un método no invasivo para observaciones de alta resolución en animales vivos utilizando windows implantables a través del cual es posible la visualización microscópica de los procesos. Este método es especialmente útil para estudiar procesos longitudinales.
Tumor y desarrollo vasos del tumor, así como la respuesta del tumor a la terapéutica, es procesos biológicos altamente dinámicos. Histología proporciona información estática y a menudo no es suficiente para una correcta interpretación. Evaluación intravital, en el que un proceso es seguido en el tiempo, proporciona información adicional y a menudo inesperada. Con la creación de animales transgénicos que expresan marcadores celulares específicos y marcadores de células vivas, mejoras en equipos de proyección de imagen y el desarrollo de varios compartimientos de la proyección de imagen, microscopia intravital se ha convertido en una herramienta importante para entender mejor procesos biológicos. Este papel describe un diseño experimental para la investigación buque de desarrollo del tumor y de los efectos terapéuticos de una manera espacial y temporal. Usando esta configuración, la etapa del desarrollo del buque punta celular y luz de formación, flujo de sangre, extravasación, un lecho vascular establecido y destrucción vascular puede ser visualizada y seguida. Además, efectos terapéuticos, sino intratumoral y la localización de compuestos quimioterapéuticos pueden también seguirse.
Mientras que en vitro estudios permiten alta resolución imágenes cinéticas de los procesos, en vitro experimentación no permiten evaluar en el contexto adecuado. Por ejemplo, la interacción de las células del tumor stromal o el suministro de medicamentos y distribución dentro de un tumor no puede ser estudiada en una placa de cultivo. Modelos animales por lo tanto se utilizan para imitar la fisiología humana y la patología. Sin embargo, la proyección de imagen longitudinal de los procesos, especialmente en una resolución subcelular, es un reto. Métodos de la proyección de imagen molecular, como la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI), emisión del solo-fotón computada tomografía (SPECT) y tomografía por emisión de positrones (PET), tienen profundidades de penetración buena pero falta resolución o dejar de ilustrar las estructuras anatómicas. La proyección de imagen óptica ofrece alta resolución y permite la proyección de imagen de las estructuras, pero se acompaña de pobres a la penetración mínima1. La aplicación de la microscopia intravital en combinación con la ventana del compartimiento de tecnologías, como una dorsal pliegue o ventana abdominal, permite alta resolución imágenes en vivo2,3,4. Esta tecnología tiene ventajas, ya que permite para la proyección de imagen longitudinal durante horas e incluso días, para la proyección de imagen de los procesos en el contexto adecuado (por ejemplo, interacciones de la célula en el tejido de la imagen) y para las resoluciones de los límites ópticos de avanzados microscopios confocales y multifotón.
La introducción de animales transgénicos con etiquetas fluorescentes específicos de la célula o proteína abre un sinfín de posibilidades para la experimentación in vivo y ex vivo . Por ejemplo, las interacciones célula-célula, la producción de proteínas y la respuesta a la manipulación o el tratamiento pueden ser estudiadas en vivo con estas modelos5,6,7,8. Lo importante es colocar en lugar y tiempo se pueden determinar con la metodología y el equipo de proyección de imagen correcto. Aquí, la microscopia intravital de animales expresan un marcador endotelial en combinación con agentes inyectables en un tumor implantado en la dorsal cámara ventana pliegue cutáneo se presenta.
Como tumor y desarrollo vasos del tumor, así como efectos terapéuticos del tumor, son procesos altamente dinámicos, intravital evaluación es una herramienta elegante para hacer una correcta evaluación de estos procesos de una manera dependiente del tiempo y espacial. Con la creciente disponibilidad de marcadores de células vivas, la creación de animales transgénicos y la promoción de modalidades de imagen, proyección de imagen de intravital se está convirtiendo en cada vez más popular. Aunque la histología se utiliza todavía de forma rutinaria, y una multitud de marcadores puede utilizarse para identificar las células y estructuras, tejido seccionado tiene desventajas al investigar procesos dinámicos. Disección del tejido es necesaria, proporcionar sólo información estática; fijación afecta la calidad del tejido; y cortar interacciones celulares. Además, la investigación de procesos dinámicos, disección del tejido en momentos diferentes y a menudo presumidos, requiere una gran cantidad de animales. Con la proyección de imagen intravital, las dimensiones espaciales XYZ y la dimensión extra de tiempo pueden ser evaluados en el mismo animal, posibilitando la colocación apropiada de los diferentes actores en el espacio y tiempo. Por lo tanto, no le falten puntos de tiempo óptimo, y se reduce significativamente el número de animales por experimento. En segundo lugar, la ventana de tiempo establecida con evaluación intravital puede ser extrapolada para optimizar la extracción de tejido. En tercer lugar, el escenario deseado de crecimiento de vasos puede identificar intravitally y manchado como un tejido de montaje en conjunto.
El diseño intravital mencionado en este manuscrito utiliza una combinación de animales transgénicos que expresan una etiqueta fluorescente en células endoteliales, la dorsal de pliegues modelo de cámara y microscopio confocal multifotón dedicado.
Las células endoteliales pasan por una serie de etapas21,22 durante la angiogénesis, y estas etapas pueden a menudo verse simultáneamente en un tumor. Utilizando la línea de ratón eNOSTag-GFP, células endoteliales individuales pueden ser seguidas, y puede rastrearse incluso filopodia dinámica. Por lo tanto es un buen modelo para estudiar el desarrollo de vasos intravitally. Dependiendo de las etiquetas intrínsecas ya presente, agentes fluorescentes inyectables pueden utilizarse para evaluar formación de lumen, flujo de sangre, extravasación y separación de la sangre. El ratón es imagen continua de hasta 5 horas. La evaluación a largo plazo de un animal es factible cuando se toman varias precauciones con respecto a la anestesia del animal, que ha sido descrito previamente23. Como esta investigación se centra en el cáncer, se implantaron tumores tejido o células. Sin embargo, también se experimentó con los metatarsos y los pulmones embrionarios. Sin embargo, la tasa de crecimiento de tejido bajo estudio está limitando, como después de un par de semanas, la piel comienza a crecer, que puede ser un problema con crecimiento lento de tumores o tejidos.
Durante la fase de validación, el dorsal que cámara ventana pliegues cutáneos se modificó considerablemente en comparación con el modelo clásico4. Los marcos están construidos con material sintético apto para el autoclave y son ligeros y pequeños, con un área grande de la ventana. El gancho del anillo de retención (figura 1Bg, punta de flecha blanca) se utiliza sólo para facilitar la extracción del anillo. Anillos de retención sin ganchos pueden utilizarse cuando éstos interfieren con la proyección de imagen. La piel no se estire demasiado, aflojamiento no ocurre en este modelo, y sólo rara vez se observan infecciones. Estas modificaciones reducen molestias animales y refinan el procedimiento animal significativamente. Además, las piezas de metal se pueden quitar fácilmente cuando proyección de imagen del tumor usando MRI24.
Cualquier microscopio puede adoptarse a intravitally imagen dorsal cámaras de pliegues cutáneos. El principal requisito es el espacio disponible entre la platina del microscopio y del objetivo. Un aspecto importante que afecta la proyección de imagen es movimiento. Para evitar artefactos de movimiento, puede usarse una plataforma que encaja en la mesa del microscopio (después de la eliminación de todas) y es compatible con el ratón. No es necesario sujetar el ratón cuando está bajo anestesia, y es mejor dejar que la respiración de ratón libremente. Sin embargo, la ventana se fija con pernos a la plataforma, dando una óptima fijación del campo de visión (es decir, el tumor es visible a través de la cámara de la ventana). La plataforma se calienta con una almohadilla de calefacción electrónica, utilizada para la calefacción del animal. Esta plataforma fue hecha interna y específicos pueden obtenerse a petición. Un objetivo de alta resolución es una necesidad cuando se evalúan los procesos intracelulares y permite discriminar entre el citoplasma y el núcleo. El uso de una lente cónica con una buena resolución óptica (NA alta) pero una relativamente larga distancia de trabajo (preferiblemente de 2 mm o más) se recomienda. La limitación en la proyección de imagen es la profundidad de penetración y la intensidad fluorescente de las etiquetas. Además, deben evitarse fotoblanqueo, fototoxicidad y saturación durante proyección de imagen.
Aquí, se utilizan un confocal multifotón integrado y un microscopio confocal. El multifotón es vertical, mientras que el confocal es un microscopio invertido. La ventaja de un microscopio vertical es el fácil uso de las lentes de inmersión en agua. Estas lentes tienen una NA alta y una larga distancia de trabajo, incluso a un aumento de alta (por ejemplo, 20 o 40 X). Específicamente, se recomienda para obtener una lente de inmersión en agua 20 X NA 1.0, que se comercializa por varias empresas. Ten en cuenta que, cuando se utilizan lentes de inmersión, el objetivo y el líquido de inmersión necesitan calentarse a 37 ° C. Para las mejores imágenes, se recomienda utilizar configuración confocal óptima (es decir, agujero de alfiler en 1 unidad de airy, laser de potencia tan bajo como sea posible, no demasiado alto (sobre todo si la ganancia introduce ruido), velocidad máxima y no con un promedio de análisis de la línea). Sobre exposición, la saturación y la diferencia de intensidades entre imágenes de comprometen la calidad de los datos. Se recomienda para evitar la saturación y la sobreexposición. Esto puede eludirse mediante la adquisición de imágenes en niveles de ganancia diferentes. Cambio de la ganancia es la forma más fácil de cambiar el brillo de la imagen. Si es necesario, puede ajustar la potencia del láser. Para estandarizar la calidad de imagen, se pueden utilizar diapositivas con una intensidad de fluorescencia fijo. Se debe tener en mente que incluso cuando el microscopio óptimo, calidad de imagen depende en gran medida de la calidad de la cámara de la ventana y el tejido
Al analizar simultáneamente varios marcadores fluorescentes, repintado, en el cual un fluoróforo es detectado en el canal de otra, debe evitarse. Evitar el repintado usando una combinación de fluoróforos con mínima superposición espectros y secuencial la exploración entre marcos. Las imágenes presentadas aquí fueron analizadas utilizando análisis secuenciales 3 (pista 1: GFP, DID o fluor647 con el laser de 488 y 633; pista 2: rodamina, Doxil o mTomato con el laser de 543; y 3: Hoechst con el láser de 405).
Aquí se muestra la posibilidad de evaluar varias etapas del desarrollo del buque tumor, punta de la célula dinámica, formación de lumen, extravasación y daño vascular. Utilizando la línea de eNOStag-GFP, áreas del tumor con un lecho vascular destruido fácilmente detectan restos celulares granulados todavía expresando GFP. Ningún agente inyectable fue detectado en estas áreas, lo que indica la falta de flujo. Esto significa que el había administrado a agentes quimioterapéuticos o bien no llegará a estas áreas. Sin embargo, la destrucción del buque también puede ser un resultado terapéutico. La evaluación del tumor, para verificar la destrucción de la nave de pretratamiento, es un requisito previo para la evaluación terapéutica precisa y puede realizarse fácilmente utilizando este diseño experimental.
Hay una plétora de posibilidades que se puede utilizar la microscopía intravital y discusión detallada está fuera del alcance de esta publicación. Para dar una visión breve, posibles aplicaciones incluyen estudios sobre la acumulación de quimioterápicos en tejido tumoral, el desarrollo de los vasos (por ejemplo, el número de buques, ramas e intersecciones) y flujo sanguíneo, las interacciones célula-célula, de la célula objetivo y procesamiento intracelular, así como los ejemplos mencionados anteriormente y se muestra a continuación. Como análisis se basan en la fluorescencia, ser conscientes de las fluctuaciones de intensidad debido a la calidad de la ventana o tejido. También, como el tejido del tumor es relativamente gruesa, fluorescencia por arriba o por debajo del plano de visión tiene un impacto en la señal en la imagen. Es mejor combinar el análisis cuantitativo de imagen con medidas objetivas. Por ejemplo, si está interesado en concentraciones de la droga, el tejido del tumor desde la ventana después de microscopia intravital y determine la droga contenida con HPLC para comparar con las imágenes confocales.
La evaluación de la respuesta del tumor puede realizarse bien con este modelo, pero con algunas precauciones. Uno debe darse cuenta de que los tumores crecen también hacia adentro, en la piel. Mediciones 3D se pueden hacer si la penetración es bastante profunda como para cubrir todo el tumor. En tal caso, deben utilizarse tintes far-red. La cámara de la ventana como describe aquí trata tumores en un entorno de piel, y es importante señalar que la ventana mantiene una temperatura ligeramente más baja que la temperatura del cuerpo normal del ratón. Por lo tanto, es mejor estudiar tumores en la derecha micro ambientación para confirmar estudios intravital con el dorsal cámara ventana pliegues cutáneos. Importante, el dorsal de pliegues de la cámara ofrece una visión de la cinética de los procesos y mecanismos, proporcionando una base instrumental para la mejora de la terapia. Además, puede obtenerse información adicional en la biodistribución y farmacocinética. Clásicamente, estos estudios de biodistribución se realizan por tratar a los animales con tumores y tumores/órganos para medir la absorción de la droga de disección. Usando este modelo intravital, la ubicación de intratumoral de un fármaco (es decir, intravascular, intratumoral, intracelular o nuclear) puede proporcionar5,25,26. No sólo es la ubicación de la droga revelada, pero también la ventana-de-oportunidad para la absorción más óptima.
Utilizando el diseño experimental descrito en este artículo, puede evaluarse una amplia gama de parámetros en un entorno temporal y espacial. En concreto, aquí mostramos que eso microscopia intravital proporciona penetraciones importantes en la dinámica del desarrollo del buque de tumor y la respuesta terapéutica.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a Rien van Haperen y Rini de Crom para su desarrollo y la donación de la línea eNOSTag-GFP, Joost A.P. Rens para su asistencia técnica con el trabajo animal y los animales guardianes por su ayuda. Las instalaciones de microscopía utilizadas son parte del centro de la proyección de imagen óptica de Erasmus, y nos gustaría agradecer al personal de la OCI para su servicio. Este estudio fue apoyado por beca 2000 DDHK-2224 de la sociedad holandesa de cáncer “Trustfonds Vereniging” Erasmus University Rotterdam y “Stichting Erasmus Heelkundig Kankeronderzoek”, y agradecemos a los miembros de los comités para su donación.
DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
PBS | |||
Window frames | Costum made | ||
Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
Eye ointment | |||
Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
0.9% NaCl | |||
Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
Window holder | Costum made | ||
tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
LAS AF Software | Leica |