DNA含有量測定法による哺乳類の複製タイミングのゲノムワイドな決意
Summary
We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.
Abstract
ゲノムの複製は、DNA複製の忠実度を保証する高度に調節されたプロセスにおける細胞周期のS期の間に起こります。それぞれのゲノム領域は、複製の複数の起源の同時活性化を介して、S期の間に明確な時に複製されます。レプリケーション（ToRの）の時間は、多くのゲノムおよびエピジェネティックな機能と相関し、突然変異率やがんにリンクされています。健康と病気で、複製プログラムの完全なゲノムビューを理解することは、主要な将来の目標や課題です。
、哺乳動物細胞のゲノムワイドのToRをマップするための簡単な方法：この記事では詳細に（CNR-のToRここでいう）メソッド」レプリケーションのゲノム時間をマッピングするためのS / G1のコピー数の比率」を説明しています。この方法は、S期細胞及びG1期の細胞の間のコピー数の差異に基づいています。 CNR-のToR法は6工程で行われる：ヨウ化プロピジウム（PI）で細胞を染色の調製。 2.ソル（FACS）を蛍光活性化細胞選別を用いた定G1及びS期細胞。 3. DNA精製。 4.超音波処理; 5.ライブラリの準備および配列決定;そして6.バイオインフォマティクス解析。 CNR-のToR方法は、詳細なレプリケーション・マップになり、迅速かつ簡単なアプローチです。
Introduction
哺乳動物のDNA複製は、細胞周期の間に正確に一度、各染色体の正確な複製を確保するために厳密に調節されています。レプリケーションは、高度に制御順序に従って発生-他のゲノム領域は、中間または後期S期（中期および後期複製ドメイン）で、後に複製する一方、複数の大規模なゲノム領域（〜Mbが）、S期（早期複製ドメイン）の先頭に複製する1。ゲノムの50％、また、癌の形質転換5中分化3,4の間及びより少ない程度に、組織2との間ののToRを変更-ゲノムのほとんど30％が、全ての組織（構成のToRドメイン）で同時に複製します。また、特定のゲノム領域は非同期6、7、8、すなわち差が複製します2対立遺伝子間のToRインチ
Torは転写レベル、GC含量、クロマチン状態、遺伝子密度など 1,9を含む多くのゲノムおよびエピ機能と相関します。 ToRのも突然変異率とタイプ10、11、したがって、当然に関連付けられている、複製プログラムの摂動は、がん12、13にリンクされています。 ToRとクロマチン構造の間の因果関係は未だ解明されていません。開いたクロマチンが早い複製を容易にすることが可能です。しかし、代替モデルは14、クロマチンは、初期および後期複製領域1のパッケージングを差動にS期リードの開始時と終了時に複製し、異なるクロマチン制御因子存在の間に組み立てられていることを示唆しています</sup>。我々は最近のToRは異なるゲノム領域11に発生する突然変異のタイプに影響を与えることによって、GC含量を整形することが示されています。
蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）は、個々の遺伝子座でのToRを測定するための主要な方法です。これは、単一のFISHシグナル対与えられた対立遺伝子15、16二重の割合を示すS期の細胞の割合をカウントすることによって簡単に行われます。別の方法は、Sに沿って複数の時点にそれらのDNA含有量に応じて細胞を選別、BrdUでDNAを標識のBrdUを含むDNAを免疫沈降し、定量PCR 17で沈殿したDNAの存在量をチェックするパルスで構成されています。
ゲノムのToRマッピングは、2つの方法によって達成することができます。第一の方法は、上述したBrdU-IPに基づく方法のゲノムのバージョンであり、ここで量の定量各分画中の沈殿したDNAは、マイクロアレイへのハイブリダイゼーションを介して、全ゲノムまたはディープシークエンシングにより同時に行われます。第二の方法、CNR-Torは、G1細胞におけるDNA含有量によってS期細胞と正規化の各ゲノム領域のコピー数を測定することに基づいています。この方法では、細胞は非複製（G1期）および（S期）基（ 図1）の複製にFACSによってソートされます。 G1の細胞はすべてのゲノム領域において同じコピー数を持っているので、それらのDNA含有量は同じである必要があります。一方、SにおけるDNAコピー数が遅く複製領域は、したがって、それらのDNA含量がするほとんどの細胞ではまだ複製していない一方で、初期の複製領域は、ほとんどの細胞で複製を受け、したがって、それらのDNA含有量が倍になるので、のToRに依存しますG1細胞のものと同様です。したがって、DNA含量のG1比Sは、のToRを示します。各ゲノム領域のためのDNAの量は、ハイブリダイゼーションによってのいずれかで測定されますマイクロアレイまたはディープシークエンシング2、8による。 CNR-のToRの方法の利点をさらに説明します。
図2で説明したように本論文では、ゲノムのToRマッピング用のCNR-のToR方法について説明します。紙は、結果の基本的な分析およびゲノムのToRマップの作成まで、細胞を採取からプロセス全体の細部を説明します。この論文に記載されているプロトコルが正常に培養で増殖させた種々の細胞型上で実行されています。このプロトコルの将来の改善は、in vivoでのToRのマッピングに、希少細胞タイプにつながることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
CNR-Torは（Rhind N.およびGilbert DM 20によってレビュー）SにFACSおよびG1相により分割することができる任意の真核生物増殖細胞集団の原理で行うことができます。ここに記載される方法は、ヒト及びマウスのような約3ギガビットのゲノムサイズを有する哺乳動物細胞に調整しました。 （細胞調製および配列決定の深さ）CNR-のToRプロトコルにおける小さな変化は、他の真核生物?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、数字を生成する際に支援するためのオリヤー語ヴァルディに感謝します。 ISグループでの作業は、イスラエル科学財団（助成番号10分の567）とグラント（＃281306）を開始し、欧州研究評議会によってサポートされていました。
Materials
| PBS | BI (Biological Industries) | 02-023-1A |
| Trypsin-EDTA | BI (Biological Industries) | 03-052-1B |
| 15ml conical tube | Corning | 430790 |
| 5ml Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap | BD-Falcon | 352235 |
| Ethanol | Gadot | 64-17-5 |
| RNAse-A 10mg/ml | Sigma | R4875 |
| Propidiom iodide 1mg/ml | Sigma | P4170 |
| parafilm | Parafilm | PM-996 |
| 1.5ml DNA LoBind Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431021 |
| BSA | Sigma | A7906 |
| 1.7ml MaxyClear tube | Axygen | MCT-175-C |
| magnetic beads – Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 |
| Ultrasonicator | Covaris | M-series -530092 |
| 50 µl microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6x16mm | Covaris | 520096 |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Invitrogen | Q32854 |
| Electrophoresis.2200 Tape station system | Agilent | D1000 ScreenTape |
| Seqeuncing – Illumina NextSeq system | Illumina | SY-415-1001 |
| Dneasy kit for DNA purification | Qiagen | 69504 |
| PureProteom Magnetic Stand | Millipore | LSKMAGS08 |
| Anti-BrdU/FITC | DAKO | F7210 |
| FACS sorter | BD | FACSARIA III |
| FACS software | BD | FACSDiva v 8.0.1 |
Referencias
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