Аптамер на основе датчика для нехелатированной гадолиния (III)

Summary

The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor.

Abstract

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd³⁺) in aqueous solution is demonstrated. Gd³⁺ is often present in samples of gadolinium-based contrast agents as a result of incomplete reactions between the ligand and the ion, or as a dissociation product. Since the ion is toxic, its detection is of critical importance. Herein, the design and usage of an aptamer-based sensor (Gd-sensor) for Gd³⁺ are described. The sensor produces a fluorescence change in response to increasing concentrations of the ion, and has a limit of detection in the nanomolar range (~100 nM with a signal-to-noise ratio of 3). The assay may be run in an aqueous buffer at ambient pH (~7 – 7.4) in a 384-well microplate. The sensor is relatively unreactive toward other physiologically relevant metal ions such as sodium, potassium, and calcium ions, although it is not specific for Gd³⁺ over other trivalent lanthanides such as europium(III) and terbium(III). Nevertheless, the lanthanides are not commonly found in contrast agents or the biological systems, and the sensor may therefore be used to selectively determine unchelated Gd³⁺ in aqueous conditions.

Introduction

Возрастающее значение магнитно – резонансной томографии (МРТ) в клинической диагностике, которая ограничена присущей чувствительности метода, привело к быстрому росту исследований в области разработки новых гадолиния основе контрастных агентов (GBCAs) ^1. GBCAs представляют собой молекулы, которые вводят для улучшения качества изображения, и они , как правило , имеют химическую структуру трехвалентного иона гадолиния (Gd ³⁺⁾ координирован с полидентатным лигандом. Это комплексообразование имеет решающее значение как нехелатированной Gd ³⁺ является токсичным; он участвует в развитии нефрогенной системного фиброза у некоторых больных с почечной недостаточностью или недостаточностью ^2. Следовательно, обнаружение водного свободного иона играет важную роль в обеспечении безопасности GBCAs. Присутствие нехелатированной Gd ³⁺ в растворах GBCA часто является результатом неполной реакции между лигандом и ионом, диссоциации комплекса или displacemenт других биологических катионов металлов ^3.

Среди нескольких методов , используемых в настоящее время для определения присутствия Gd ^3+, те , которые полагаются на хроматографии и / или спектрометрического ранга высшей точки зрения универсальности и применимости ^4. Среди их сильные стороны являются высокая чувствительность и точность, возможность анализа различных матриц проб ( в том числе сыворотки человека ^5, мочи и волос ^{6, 7} сточной воды, а также композиций , агентов контрастных ^8), а также одновременного количественного определения нескольких ³⁺ комплексов Gd (листинг исследований до 2013 года описана в комплексном обзоре Telgmann и др.) ^4. Единственным недостатком является то, что некоторые из этих методов требует контрольно- измерительные приборы (например, с индуктивно связанной плазмой масс – спектрометрии) ⁴ , что некоторые лаборатории не могут иметь доступ. В контексте нового открытия GBCA на исследования и доказательство правильности концепции уровней, арelatively более удобный, быстрый и экономически эффективный метод спектроскопического основе (например, УФ-Vis поглощения или флуоресценции), может служить ценным альтернативой. С помощью этих приложений в виду, флуоресцентный аптамеры на основе датчика для водного раствора Gd ³⁺ был разработан ^9.

Аптамеров (Gd-аптамеров) представляет собой 44-щелочное долго одноцепочечной молекулой ДНК с определенной последовательностью оснований, выделенный в процессе систематического выделение лигандов экспоненциальным обогащением (SELEX) ^9. Для адаптации аптамер в флуоресцентным датчиком, флуорофор присоединен к концу 5 'нити, которая затем гибридизуют с жаждоутоляющей нити (QS) через 13 дополнительных оснований (рисунок 1). QS помечен темной молекулой гасителя на 3'-конца. При отсутствии Gd ^3+, датчик (Gd-сенсор), состоящий из соотношении 1: 2 моль Г.Д.-аптамеров и QS соответственно будут иметь минимальное излучение флуоресценции из – за тпередача энергии от о флуорофора к гасителя. Добавление водного раствора Gd ³⁺ сместит QS из Gd-аптамеров, что приводит к увеличению флуоресцентной эмиссии.

Рисунок 1. Датчик (Gd-сенсор) , который состоит из 44-основания длинной аптамеров (Gd-аптамеров) метили флуоресцеина (флуорофор) и 13-база длиной цепи закалки (QS) помеченным dabcyl (темный гасителя) , При отсутствии нехелатированной Gd ^3+, флуоресценция датчика минимальна. С добавлением Gd ^3+, смещение QS происходит и наблюдается увеличение эмиссии флуоресценции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Существует в настоящее время широко используется один спектроскопического основе метод обнаруженияИНГ водного Gd ^3+. В этом анализе используют молекулу ксиленоловым апельсин, обнаруживающая сдвиг максимума длины волны поглощения от 433 до 573 нм при хелятации к иону ^10. Отношение этих двух максимумов поглощения могут быть использованы для определения количества нехелатированной Gd ^3+. Датчик аптамеров является альтернативой (также может быть комплементарной) к ксиленол оранжевого анализа, поскольку эти два метода имеют разные условия реакции (например, рН и состав буферных растворов, используемых), задачи селективностью, линейные диапазоны количественной оценки, а также методов обнаружения ^9.

Protocol

Примечание: Молекулярная биология класс вода используется во всех буферных растворов и препаратов. Все одноразовые трубки (микроцентрифужных и ПЦР) и пипетки советы DNase- и РНКазы. Пожалуйста, обратитесь к листам безопасности (MSDS) для всех химических веществ перед использованием. Исполь…

Representative Results

Типичное изменение флуоресценции раствора Gd-датчика в присутствии нехелатированной Gd 3+ показана на рисунке 2. Излучение может быть нанесены в виде изменения флуоресценции кратному (фиг.2А) , или сырой флуоресценции чтения (Фигура 2В) в ?…

Discussion

Использование аптамеров на основе Gd-сенсор, увеличение эмиссии флуоресценции, которая пропорциональна концентрации нехелатированной Gd ³⁺ наблюдается. Для того, чтобы свести к минимуму количество используемого образца, анализ может выполняться в микропланшет 384-луночного с общи?…

Materials

Gd-aptamer	IDTDNA	Input sequence and fluorophore modification in the order form	A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Quenching strand	IDTDNA	Input sequence and quencher modification in the order form	A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Molecular biology grade water			No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well
Gadolinium(III) chloride anhydrous	Strem	936416	Toxic
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Magnesium chloride anhydrous	MP Biomedicals	0520984480 – 100 g
Sodium Chloride	Acros Organics	327300025
Potassium chloride	Fisher Scientific	P333-500
Sodium hydroxide, pellets	Fisher Scientific	BP359	Corrosive
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	SA49	Toxic and corrosive
384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates	Corning	3575	Plates which are suitable for fluorescence reading are required.
Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter	Thermo Scientific	5680020	The bottle top is fitted with  0.2 micron PES membrane
Disposable sterile bottles 250 mL	Corning	430281	A larger or smaller bottle may be used
1.5 mL microcentrifuge tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
0.2 mL PCR tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Micropipets			No specific manufacturer
Pipet tips (non filter) of appropriate sizes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Name of Equipment
Plate reader	Biotek Synergy H1		Plate readers from other manufacturers would work equally well