Einzelmolekülanalyse von Laser Lokalisierte Psoralen Addukten
Summary
Laser werden häufig in Untersuchungen der zellulären Antwort auf DNA-Schädigung verwendet. Jedoch erzeugen sie Läsionen, deren Abstand, Frequenz und Kollisionen mit Replikationsgabeln werden selten charakterisiert. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der die Bestimmung dieser Parameter mit Laser lokalisiert Interstrang- Vernetzungen ermöglicht.
Abstract
Die DNA-Schadensantwort (DDR) wurde in Studien von Doppelstrangbrüchen (DSB), induziert durch Lasermikrostrahlbestrahlung in lebenden Zellen extensiv charakterisiert. Die DDR helix DNA kovalente Modifikationen verzerrenden, einschließlich Interstrang- DNA-Vernetzungen (ICL), ist nicht so gut definiert. Wir haben die von ICLs stimuliert DDR studiert, lokalisiert durch Laser-Photoaktivierung von immunotagged Psoralene, in den Kernen von lebenden Zellen. Um grundlegende Fragen über Adduktverteilung und Replikationsgabel Begegnungen zu adressieren, kombinierten wir Laser-Lokalisierung mit zwei anderen Technologien. DNA-Fasern werden häufig während kurzer Impulse integriert anzuzeigen, den Fortschritt der Replikationsgabeln durch Immunofluoreszenz von Nukleosidanaloga verwendet. Immunoquantum Punkte wurden für Einzelmolekül-Bildgebung weit verbreitet. In dem neuen Ansatz, DNA Fasern aus Zellen, den Laser-lokalisierte ICLs werden auf Objektträger verteilt. Die markierten ICLs sind mit immunoquantum Punkten und th angezeigte inter-Läsion Entfernungen bestimmt. Replikationsgabel Kollisionen mit ICLs visualisiert und andere Begegnung Muster identifiziert und quantifiziert werden.
Introduction
DNA wird unter konstantem Angriff von exogenen Mitteln wie Strahlung, ultraviolettem Licht, Umweltgifte, Verbrennungsprodukte, etc. Darüber hinaus ist es auch durch endogene Radikalspezies hergestellt durch oxidative Stoffwechsel angegriffen wird. All diese Faktoren haben das Potenzial , chemisch oder physikalisch die Integrität der DNA – 1 zu stören. Störungen in dem Genom können die DNA-Schadensantwort (DDR) aktivieren, eine Rekrutierung und posttranslationale Modifikation Kaskade mit Hunderten, wenn nicht Tausende von Proteinen und in Läsion Reparatur beteiligt microRNAs, Regulation des Zellzyklus, Apoptose, Seneszenz und Entzündungsweg 2.
Die meisten unserer Informationen über die DDR stammt aus Studien mit DSBs. Dies ist zum großen Teil durch die Verfügbarkeit von Technologien für Brüche sind , darunter ein sequenzspezifische Pausen, in genomischer DNA in lebenden Zellen 3. Darüber hinaus ist die propensity von Pausen Brennpunkte der DDR-Proteine zu induzieren, die durch Immunofluoreszenz angezeigt werden können, ist sehr hilfreich für die Bestimmung der Kinetik und Anforderungen des Antworten Proteine. Eine der Schlüsseltechnologien für die DDR studiert wurde von Bonner und Kollegen vorgestellt, die einen Laserstrahl verwendet , 4 einen Streifen von DSBs in einer „Region of Interest“ (ROI) in den Kernen von lebenden Zellen zu lenken. In der Tat haben sie einen langen Fokus, in denen Proteine der DDR können durch Immun identifiziert werden. Dies wurde durch die Demonstration der starken Streifen von phosphoryliertem Histon H2AX (γ-H2AX) in den Laser-exponierten Zellen veranschaulicht. Seitdem hat sich der Laser Ansatz in zahlreichen Studien der DDR eingesetzt wurden durch DSBs induziert. Obwohl mächtig und beliebt, und die Quelle der dramatischen Immun Bilder, sei darauf hingewiesen, dass in den meisten Experimenten die Laserintensität eingestellt wird, um beobachtbare Ergebnisse zu produzieren, ohne Sorge um die Läsion Identität,Dichte oder Abstand. Tatsächlich kann es schwierig sein, diese Schätzungen. So sind sie weitgehend ignoriert, trotz der Vielzahl der in die DNA eingeführt Läsionen durch Laser 5. Dies trägt zu den vielen Widersprüche in der Literatur 6.
Im Gegensatz zu DSBs meisten chemischen Modifikationen der DNA nicht stimulieren die Bildung von diskreten Foci von DDR-Proteinen. Dies ist wichtig im Hinblick auf unserem gegenwärtigen Verständnis der Läsion Frequenzen. Es wird geschätzt, dass menschliche Zellen in Kultur nicht weniger als 50 DSBs pro Zellzyklus entstehen, 7 weitgehend während der S – Phase gebildet, 8, 9. Weniger in nicht-proliferierenden Zellen gebildet. Dies kontrastiert mit der Anzahl von Nukleobasen Verluste oder Änderungsereignisse, die 1 in die Zehntausende pro Zelle / Tag, 10. So wissen wir am meistendie DDR durch Ereignisse induziert, die relativ selten sind, und viel weniger über die von Helix zu verzerren Läsionen induziert, die weitaus häufiger in Aggregat sind.
Um Fragen über die zelluläre Antwort zu adressieren Modifikationen der genomischen DNA kovalent, wollten wir mit einer Helix verzerrenden DNA-Addukt arbeiten, die inhärente DDR Induktionsaktivität hatte. Darüber hinaus erleichtern experimentelles Design und Interpretation, die wir waren in einer Struktur, deren Einführung interessiert Bezug auf die Zeit kontrolliert werden konnte und war offen für die Visualisierung. Dementsprechend entwickeln wir eine Strategie, die auf Psoralen. AT sites: Psoralene sind gut photoaktive DNA-Interkalatoren begünstigende 5' TA gekennzeichnet. Im Gegensatz zu anderen Vernetzungsmitteln wie beispielsweise Stickstoffsenfgase und Mitomycin C (MMC) sie sind nicht reaktiv, es sei denn DNA ausgesetzt langwelligem UV (UV-A) Licht. Die interkalierten Moleküle reagieren mit Thymin-Basen auf gegenüberliegenden Strängen helix verzerrenden Interstrang-Vernetzungen (ICLs herzustellen) 11. Mit dem Psoralen trimethyl in unseren Experimenten verwendeten die meisten Produkte sind ICLs, relativ wenige Monoaddukte erzeugt werden (weniger als 10%) 12 und Intrastrang – Quervernetzungen zwischen benachbarten Basen auf einem Strang nicht ausgebildet sind . Weil sie leistungsfähiger Blöcke Replikation und Transkription, Psoralen und andere Vernetzungsmittel sind, wie cis-Platin und MMC, werden in der Chemotherapie eingesetzt. Somit Psoralen Studien ermöglichte, dass die Aktivierung der DDR durch eine Helixstruktur zu verzerren, gefolgt, und auch einen Einblick in die zelluläre Antwort auf eine Verbindung mit der klinischen Bedeutung zur Verfügung gestellt.
Wir ein Reagenz synthetisiert, in dem trimethylpsoralen verknüpft wurde an Digoxigenin (Dig), ein pflanzliches Sterin nicht in Säugerzellen gefunden und häufig als immunotag verwendet. Die Anforderung für die Photoaktivierung erlaubt die Lokalisierung von Laserlicht (365 nm) von Psoralen ICLs in definierten ROI in Kernen in lebenden Zellen. Diese können durch imm angezeigt werdenunofluorescence gegen das Markierungs-Dig. DNA – Reparatur und DDR – Proteine erschienen in den Streifen des Laser lokalisierten ICLs 13, 14.
Die DDR durch die hohen Laserintensitäten aktiviert verwendet DSBs produzieren könnte 15 aufgrund isoliert oder gruppierten Schaden sein, 16. Folglich ist die Relevanz der Ergebnisse aus diesen Experimenten natürlich Läsionen vorhanden bei viel niedrigeren Konzentration auftritt, ist ungewiss. Um ähnliche Fragen zu Psoralen Addukts Frequenz und Abstand in der DNA – Adresse, nutzten wir DNA – Fasertechnologie 17 und immunoquantum Punkte. Quantenpunkte sind deutlich heller als Fluoreszenzfarbstoffe und sind nicht durch Belichtung gebleicht. So werden sie häufig für Einzelmolekül – Bildgebung verwendet 18, eine Anwendung , für die Fluoreszenzfarbstoffe nicht ausreichend hell sein . Einzelne DNA-Fasern können auf g gestrecktlass Dias und können während der Inkubationen vor der Zellernte eingebracht durch Immunofluoreszenz gegen Nukleosidanaloga angezeigt werden. Wir behandelten Zellen mit Dig-Psoralen und den ROI zu Lasermikrobestrahlung ausgesetzt. Die Fasern wurden aus den Zellen und einzelne Dig-Psoralen-Addukte hergestellt mit den immunoquantum Punkte sichtbar gemacht werden konnten. die Zellen ausgesetzt Analoga für relativ kurze Zeiten Nukleosid (20-60 min) ermöglicht die Anzeige der Replikationsweg in der Nähe des Laser lokalisierte ICLs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Laser-Lokalisierungstechnologie erfordert die Verwendung von adhärenten Zellen mit Kernen, die in Hellfeld-Mikroskopie sichtbar sind. Wir haben versucht, nicht-adhärente Zellen, wie primäre Lymphozyten zu befestigen, oder lose anhaftenden Kulturzellen wie AD293, auf die Glasoberfläche mit zelladhäsiven Zubereitungen wie Polylysin oder Collagen, oder komplexere Mischungen. Obwohl diese Behandlungen die Zellen an die Oberfläche binden kann, finden wir, dass sie in der Regel gerundet bleiben, was es sehr schwieri…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde teilweise durch die Intramural Research Program des NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) und dem Fanconi Anemia Research Fund unterstützt.
Materials
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100ml | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
Referencias
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