El análisis de moléculas individuales de láser localizadas psoraleno aductos
Summary
Los láseres se utilizan con frecuencia en los estudios de la respuesta celular al daño del ADN. Sin embargo, que generan lesiones cuya distancia, la frecuencia y las colisiones con las horquillas de replicación están raramente caracterizado. Aquí se describe un método que permite la determinación de estos parámetros con láser localizado entrecruzamientos entre cadenas.
Abstract
La respuesta al daño del ADN (DDR) se ha caracterizado ampliamente en estudios de doble filamento se rompe (DSBs) inducida por irradiación con haz de micro láser en células vivas. El DDR a la hélice que distorsionan modificaciones del ADN covalentes, incluyendo entrecruzamientos de ADN entre hebras (ICL), no está tan bien definida. Hemos estudiado la DDR estimulado por ICL, localizada por fotoactivación de psoralenos láser immunotagged, en los núcleos de las células vivas. Con el fin de abordar cuestiones fundamentales sobre distribución de aductos y encuentros horquilla de replicación, se combinaron localización láser con otras dos tecnologías. fibras de ADN se utilizan a menudo para mostrar el progreso de las horquillas de replicación por inmunofluorescencia de análogos de nucleósidos incorporados durante pulsos cortos. puntos Immunoquantum han sido ampliamente empleado para obtener imágenes de una sola molécula. En el nuevo enfoque, las fibras de ADN de las células que llevan ICL láser localizada se extendieron sobre portaobjetos de microscopio. Las ICL etiquetados se muestran con puntos immunoquantum y THe distancias entre las lesiones determinadas. colisiones horquilla de replicación con ICL se pueden visualizar y diferentes patrones de encuentro identificaron y se cuantificaron.
Introduction
DNA está bajo asalto constante de los agentes exógenos tales como la radiación, luz ultravioleta, toxinas ambientales, productos de combustión, etc. Además, también es atacado por las especies de radicales endógenos producidos por el metabolismo oxidativo. Todos estos tienen el potencial de alterar química o físicamente la integridad del ADN 1. Las perturbaciones en el genoma pueden activar la respuesta al daño del ADN (DDR), un reclutamiento y la cascada de la modificación post traduccional con cientos, si no miles, de proteínas y microRNAs implicados en la reparación de la lesión, la regulación del ciclo celular, apoptosis, senescencia, y las vías inflamatorias 2.
La mayor parte de nuestra información sobre el DDR proviene de estudios con DSB. Esto es en gran parte debido a la disponibilidad de tecnologías para la introducción de roturas, incluidas las pausas específicos de secuencia, en el ADN genómico en las células vivas 3. Además, el propensity de descansos para inducir focos de proteínas de DDR, que se pueden visualizar mediante inmunofluorescencia, ha sido muy útil para la identificación de la cinética y requerimientos de proteínas que responden. Una de las tecnologías clave para el estudio de la DDR fue introducido por Bonner y colegas, que utiliza un rayo láser para dirigir una banda de DSBs en una "región de interés" (ROI) en los núcleos de las células vivas 4. En efecto, crearon un enfoque muy largo en el que las proteínas de la RDA podrían ser identificados por inmunofluorescencia. Esto se ilustró por su demostración de la fuerte de la raya de la histona H2AX fosforilado (γ-H2AX) en las células expuestas a láser. Desde entonces, el enfoque de láser se ha empleado en numerosos estudios de la DDR inducidos por DSBs. Aunque potente y popular, y la fuente de las imágenes de inmunofluorescencia dramáticos, cabe señalar que en la mayoría de los experimentos de la intensidad del láser se ajusta a fin de producir resultados observables, sin preocuparse por la identidad de la lesión,densidad, o espaciado. De hecho, puede ser difícil hacer estas estimaciones. Por lo tanto son ignorados en gran medida, a pesar de la multiplicidad de las lesiones introducidos en ADN por láser 5. Esto contribuye a las muchas contradicciones en la literatura 6.
En contraste con DSBs, la mayoría de modificaciones químicas de ADN no estimulan la formación de focos discretos de las proteínas de DDR. Esto es importante a la luz de nuestra comprensión actual de las frecuencias de la lesión. Se ha estimado que las células humanas en cultivo incurren en tanto como 50 DSBs por ciclo celular, formadas en gran medida durante la fase S 7, 8, 9. Menos se forman en las células no proliferativas. Esto contrasta con el número de pérdidas de nucleobases o eventos de modificación, que están en las decenas de miles por célula / día 1, 10. Por lo tanto, la mayoría sabemos acercala DDR inducida por eventos que son relativamente raras, y mucho menos acerca de los inducidos por lesiones hélice distorsión, que en conjunto son mucho más comunes.
Con el fin de abordar cuestiones relativas a la respuesta celular a las modificaciones covalentes de ADN genómico, queríamos trabajar con una hélice que distorsionan aductos de ADN que tenía actividad inherente de inducción DDR. Además, para facilitar el diseño experimental y la interpretación que estábamos interesados en una estructura cuya introducción podría ser controlado con respecto al tiempo y era susceptible de visualización. En consecuencia, hemos desarrollado una estrategia basada en psoraleno. Los psoralenos están bien caracterizados intercaladores de ADN fotoactivos que favorecen 5' TA: AT sitios. A diferencia de otros agentes de reticulación tales como mostazas de nitrógeno y mitomicina C (MMC) que no son ADN reactiva a menos expuesto a la luz UV de onda larga (UVA). Las moléculas intercaladas reaccionan con bases de timina en hebras opuestas para producir hélice distorsionar reticulaciones entre cadenas (ICL) 11. Con el psoraleno trimetil usado en nuestros experimentos mayoría de los productos son ICL, se generan relativamente pocos monoaductos (menos de 10%) 12, y reticulaciones intracatenarios entre bases adyacentes en una cadena no se forman. Debido a que son potentes bloques a la replicación y transcripción, psoraleno y otros agentes de reticulación, como cis-platino y MMC, se utilizan comúnmente en la quimioterapia. Por lo tanto permitido psoraleno estudios que siguieron a la activación de la DDR por una estructura que distorsionan hélice, y también proporcionado información sobre la respuesta celular a un compuesto con importancia clínica.
Se sintetizaron un reactivo en el que psoraleno trimetil estaba relacionado con digoxigenina (Dig), un esterol de planta no se encuentra en células de mamífero y se utiliza con frecuencia como un immunotag. El requisito para la fotoactivación permite la localización por la luz láser (365 nm) de ICL de psoraleno en ROI definido en núcleos en las células vivas. Éstas se pueden representar por la IMMunofluorescence contra la etiqueta Dig. La reparación del ADN y las proteínas de DDR aparecieron en las rayas de láser localizadas ICL 13, 14.
El DDR activado por las intensidades altas de láser usados para producir DSBs podría ser debido al daño aislado o agrupado 15, 16. En consecuencia, la relevancia de los resultados de estos experimentos a lesiones de origen natural, presente en mucho menor concentración, es incierto. Para hacer frente a preguntas similares acerca de la frecuencia aducto psoraleno y el espaciamiento en el ADN, nos aprovechamos de la tecnología de fibra de ADN y 17 puntos immunoquantum. Los puntos cuánticos son mucho más brillantes que los tintes fluorescentes y no se blanquean por la exposición a la luz. Por lo tanto se utilizan con frecuencia para la imagen única molécula de 18, una solicitud de que los colorantes fluorescentes no son suficientemente brillante. fibras de ADN individuales se pueden estirar en gdiapositivas Lass y se pueden visualizar por inmunofluorescencia contra análogos de nucleósidos incorporados durante incubaciones anteriores a la celda de la cosecha. Se han tratado las células con Dig-psoraleno y expuesta la ROI a micro láser irradiación. Las fibras se preparan a partir de las células y los aductos individuales DIG-psoraleno puede ser visualizado con los puntos immunoquantum. Exponer las células a los análogos de nucleósidos para tiempos relativamente cortos (20-60 min) permite la visualización de secciones de replicación en las proximidades de los ICLs láser localizado.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnología de localización láser requiere el uso de células adherentes con núcleos que son visibles en microscopía de campo claro. Hemos tratado de unir las células no adherentes, tales como linfocitos primarios, o células cultivadas de baja adherencia, tales como AD293, a la superficie de cristal con preparaciones adhesivas de células tales como polilisina o colágeno, o mezclas más complejas. Aunque estos tratamientos pueden unir las células a la superficie, nos encontramos con que por lo general se qued…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada en parte por el Programa de Investigación Intramural del NIH, Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (Z01 AG000746-08) y el Fondo de Investigación de Anemia de Fanconi.
Materials
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100ml | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
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