ניתוח מולקולה בודדת של מותאמת לשפה לייזר Psoralen Adducts
Summary
לייזרים משמשים לעתים קרובות במחקרים של התגובה התאית לנזקי DNA. עם זאת, הם מייצרים נגעים אשר מרווח, תדירות, ואת התנגשויות עם מזלגות שכפולים נדירות מאופיינות. כאן, אנו מתארים גישה המאפשרת קביעת פרמטרים אלה עם crosslinks interstrand לייזר מקומי.
Abstract
תגובת נזק לדנ"א (DDR) התאפיינה בהרחבה במחקרים של הפסקות גדיל כפול (DSBs) המושרה על ידי הקרנה קרן מיקרו לייזר בתאים חיים. המזרח-גרמנית Helix מעוותת שינויים DNA קוולנטי, כולל crosslinks interstrand DNA (ICLs), הוא לא כמו גם מוגדר. למדנו את DDR מגורה על ידי ICLs, למקום על ידי לייזר photoactivation של psoralens immunotagged, האצור בגרעיני התאים לחיות. על מנת לענות על שאלות בסיסיות אודות חלוקת adduct ומפגשים מזלג שכפול, שילבנו לוקליזציה לייזר עם שתי טכנולוגיות אחרות. סיבים DNA משמשים לעתים קרובות כדי להציג את ההתקדמות של מזלגות שכפול ידי immunofluorescence של אנלוגים nucleoside שולבו במהלך פולסים קצרים. נקודות Immunoquantum הועסקו נרחב עבור הדמית מולקולה בודדת. לפי הגישה החדשה, סיבים DNA מתאי נושאת ICLs מקומי לייזר פרוסים על גבי שקופיות מיקרוסקופ. ICLs מתויגת מוצגת עם נקודות immunoquantum ו המרחקי e-נגע השאר נקבעו. שכפול מזלג התנגשויות עם ICLs ניתן דמיינו ודפוסי מפגש שונים מזוהים ונרשמים.
Introduction
DNA נמצאת תחת מתקפה מתמדת מצד סוכנים חיצוניים כגון קרינה, אור אולטרה סגול, רעלים סביבתיים, תוצרי בעירה, וכו 'בנוסף, הוא תקף גם על ידי מינים רדיקליים אנדוגניים מיוצרים על ידי מטבוליזם חמצונים. לכל אלה פוטנציאל כימי או פיזי לשבש את תקינות DNA 1. הפרעות בגנום יכול להפעיל את תגובת נזק לדנ"א (DDR), גיוס ומתפזרות שינוי פוסט translational עם מאות, אם לא אלפי, של חלבונים מיקרו-רנ"א מעורב תיקון הנגע, הסדרת מחזור התא, אפופטוזיס, הזדקנות, והמסלולים דלקתיות 2.
רוב המידע שלנו לגבי DDR מגיע ממחקרים עם DSBs. זהו במידה רבה בשל הזמינות של טכנולוגיות מציגים הפסקות, כוללים רצף הפסקות ספציפיות, ב DNA הגנומי בתאים חיים 3. בנוסף, propensity של הפסקות לגרום מוקדים של חלבונים DDR, אשר יכול להיות מוצג על ידי immunofluorescence, עזר לי מאוד לזיהוי קינטיקה והדרישות של חלבונים להגיב. אחת מהטכנולוגיות מפתח ללימוד DDR הוצג על ידי בונר ועמיתיו, שהשתמשו קרן לייזר לכוון פס של DSBs בתוך "אזור של אינטרס" (ROI) האצור בגרעיני התאים החיים 4. למעשה, הם יצרו מוקד ארוך, שבו חלבונים של DDR יכולים להיות מזוהים על ידי immunofluorescence. הדבר הומחש על ידי ההפגנה שלהם של הפס החזק של H2AX היסטון פוספורילציה (γ-H2AX) בתאים שנחשפו הליזר. מאז, הגישה לייזר כבר המועסקים מחקרים רבים של DDR המושרה על ידי DSBs. למרות חזק ופופולרי, ואת המקור של תמונות immunofluorescence דרמטיות, יש לציין כי ברוב הניסויים עוצמי הליזר מותאם על מנת לייצר תוצאות נצפות, בלי דאגת זהות נגע,צפיפות, או ריווח. ואכן, זה יכול להיות קשה לבצע אומדנים אלה. לכן הם התעלמו במידה רבה, למרות ריבוי הנגעים הציגו לתוך ה- DNA על ידי לייזרים 5. זה תורם סתירות רבות בספרות 6.
בניגוד DSBs, השינויים הכימיים ביותר של דנ"א לא לעורר היווצרות מוקדים הנפרדים של חלבוני DDR. זה חשוב לאור ההבנה הנוכחית שלנו של תדרי נגע. ההערכה היא כי תאי האדם בתרבות נגרמו רבים ככל 50 DSBs לכל מחזור התא, נוצר ברובו במהלך S שלב 7, 8, 9. פחות נוצרים בתאים שאינם מתרבים. זאת בניגוד מספר הפסדים nucleobase או אירועים שינוי, אשר נמצאים עשרות אלפי לכל תא / יום 1, 10. לפיכך, אנו יודעים הכימהרפובליקה מושרה על ידי אירועים נדירים יחסית, והרבה פחות על אלה המושרים על ידי נגעים מעוותי סליל, אשר במצטבר שכיח הרבה יותר.
על מנת לענות על שאלות לגבי תגובת התאים קוולנטיים שינויים של DNA גנומי, רצינו לעבוד עם adduct DNA מעוותת Helix שיש פעילות אינדוקציה DDR הטבועה. יתר על כן, כדי להקל על עיצוב ניסיוני ופרשנות היינו מעוניינים מבנה המבוא אשר יכול להיות נשלט ביחס לזמן והיה מקובל ויזואליזציה. בהתאם לכך, פיתחנו אסטרטגיה המבוססת על psoralen. Psoralens גם מאופיינים intercalators DNA photoactive העדפת 5' ת"א: באתרים. בניגוד סוכנים crosslinking אחרים כגון חרדל חנקן ו mitomycin C (MMC) הם אינם DNA תגובתי אלא חשופים גל ארוך UV (UVA) אור. מולקולות intercalated מגיבות עם בסיסי תימין על גדילי היפך לייצר crosslinks interstrand מעוותת סליל (ICLs11). עם psoralen trimethyl השתמש בניסויים שלנו רוב המוצרים הם ICLs, מעטים יחסית monoadducts נוצר (פחות מ 10%) 12, ו crosslinks intrastrand בין בסיסים הסמוכים על גדיל אחד לא נוצר. מכיוון שהם אבני עוצמה כדי שכפול שעתוק, psoralen וסוכני crosslinking אחרים, כמו ציס-פלטינה ו- MMC, משמשים בדרך כלל כימותרפיה. לפיכך psoralen לאפשר מחקרים שלאחר הפעלת DDR ידי מבנה מעוות Helix, וגם ספקו תובנה התגובה התאית למתחם עם חשיבות קלינית.
אנחנו מסונתז ריאגנט שבו psoralen trimethyl היה מקושר digoxigenin (DIG) חברה sterol הצמח לא נמצא בתאי יונקים שימוש תכוף כמו immunotag. הדרישה עבור photoactivation מתיר לוקליזציה ידי אור לייזר (365 ננומטר) של ICLs psoralen ב ROI מוגדר בגרעין בתאים חיים. אלה יכולים להיות מוצגים על ידי IMMunofluorescence נגד תג Dig. תיקון דנ"א וחלבונים DDR הופיעו פסים של לייזר מקומי 13 ICLs, 14.
מהרפובליקה מופעל על ידי בעוצמות לייזר גבוהה משמש לייצור DSBs יכול להיות בגלל הנזק מבודד או מקובצים 15, 16. כתוצאה מכך, את הרלוונטיות של תוצאות מניסויים אלה המתרחשים נגעים טבעיים, נוכח הרבה ריכוז נמוך, אינו ברור. כדי לענות על שאלות דומות לגבי תדירות adduct psoralen והריווח ב DNA, לקחנו את היתרונות של טכנולוגיית סיבים DNA 17 ונקודות immunoquantum. נקודות קוונטיות הן הרבה יותר בהירות צבעי ניאון ואינם מולבנות על ידי חשיפה לאור. לכן הם משמשים לעתים קרובות עבור הדמית מולקולה בודדת 18, בקשה אשר צבעי ניאון בהירים מספיק. ניתן למתוח סיבי DNA בודדים על gמגלשות נַעֲרָה ויכולים להיות מוצגות על ידי immunofluorescence נגד אנלוגים nucleoside שולבו במהלך incubations לפני תא קציר. התייחסנו תאים עם Dig-psoralen וחשף את ההחזר על ההשקעה הקרנה מיקרו לייזר. סיבים הוכנו מן התאים adducts Dig-psoralen הפרט יכול להיות דמיינו עם הנקודות immunoquantum. חשיפת תאי nucleoside אנלוגים לזמנים קצרים יחסית (20-60 דקות) מאפשרת את התצוגה של שטחים שכפולים בסביבה של ICLs הליזר מקומי.
Protocol
Representative Results
Discussion
הטכנולוגיה לוקליזציה לייזר מחייב שימוש בתאי חסיד עם גרעינים הנראים מיקרוסקופ שדה בהיר. ניסינו לצרף תאי nonadherent, כגון לימפוציטים עיקרי, או תאים בתרבית חסיד רופף כמו AD293, אל משטח הזכוכית עם הכנות דבקות תא כגון polylysine או קולגן, או תערובות מורכבות יותר. למרות טיפולים אלה עשו…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן בחלקו על ידי תכנית המחקר העירונית של NIH, המכון הלאומי להזדקנות (Z01 AG000746-08) וקרן מחקר אנמיה Fanconi.
Materials
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100ml | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
Referencias
- Lindahl, T. The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).
- Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).
- Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O’Neill, P. Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage – when is a DSB not a DSB?. Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).
- Aguilera, A., Garcia-Muse, T. Causes of genome instability. Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).
- Swenberg, J. A., et al. Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment. Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).
- Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions. J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).
- Lai, C., et al. Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation. Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).
- Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells. J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).
- Nowsheen, S., et al. Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues. Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).
- Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).
- Huang, J., et al. Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks. Front Genet. 7, 84 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).
- Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts. Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).
- Poirier, M. C. Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples. Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).
- Henderson, A., et al. Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).
