Singolo Analisi Molecola di laser localizzati psoraleni addotti
Summary
I laser sono spesso utilizzati in studi di risposta cellulare al danno del DNA. Tuttavia, essi generano lesioni la cui spaziatura, frequenza, e collisioni con forcine di replicazione sono raramente caratterizzati. Qui, descriviamo un approccio che consente la determinazione di questi parametri con laser localizzato legami crociati interstrand.
Abstract
La risposta al danno del DNA (DDR) è stato ampiamente caratterizzato in studi di rotture dei filamenti doppi (DSB) indotta dal laser micro irradiazione con fascio di cellule vive. DDR a Helix distorsione modificazioni covalenti DNA, tra interstrand legami crociati DNA (ICL), non è così ben definita. Abbiamo studiato la DDR stimolato da ICL, localizzato dalla fotoattivazione laser di psoraleni immunotagged, nei nuclei delle cellule vive. Per affrontare domande fondamentali sulla distribuzione addotto e incontri replica forcella, abbiamo combinato localizzazione laser con altre due tecnologie. fibre di DNA sono spesso utilizzati per visualizzare l'avanzamento delle forche di replicazione mediante immunofluorescenza di analoghi nucleosidici, incorporati durante impulsi brevi. puntini Immunoquantum sono stati ampiamente utilizzati per l'imaging singola molecola. Nel nuovo approccio, fibre di DNA da cellule portatrici laser localizzato ICLs sono distribuite su vetrini da microscopio. Le targhette ICL vengono visualizzati con punti immunoquantum e the distanze tra le lesioni determinate. collisioni replica forcella con ICL possono essere visualizzati e diversi modelli incontro identificate e quantificate.
Introduction
DNA è sotto costante aggressione dagli agenti esogeni come radiazione, luce ultravioletta, tossine ambientali, prodotti di combustione, ecc Inoltre, è attaccato anche da specie radicaliche endogene prodotte dal metabolismo ossidativo. Tutti questi hanno il potenziale di distruggere chimicamente o fisicamente l'integrità del DNA 1. Perturbazioni nel genoma possono attivare la risposta al danno del DNA (DDR), un reclutamento e post traslazionale modifica a cascata con centinaia, se non migliaia, di proteine e microRNA coinvolti nella riparazione della lesione, regolazione del ciclo cellulare, apoptosi, senescenza e vie infiammatorie 2.
La maggior parte delle nostre informazioni sulla DDR viene da studi con DSB. Ciò è in gran parte a causa della disponibilità di tecnologie per introdurre le pause, comprese le pause sequenza specifica, nel DNA genomico nelle cellule viventi 3. Inoltre, il propensity di pause per indurre foci di proteine DDR, che possono essere visualizzati mediante immunofluorescenza, è stato molto utile per identificare la cinetica ei requisiti di proteine rispondere. Una delle tecnologie chiave per lo studio della DDR è stato introdotto da Bonner e colleghi, che ha usato un raggio laser per dirigere una striscia di DSB in una "regione di interesse" (ROI) nei nuclei delle cellule viventi 4. In effetti, hanno creato un lungo fuoco in cui le proteine del DDR potevano essere identificati mediante immunofluorescenza. Ciò è stato illustrato dalla loro dimostrazione della forte banda di fosforilata H2AX istone (γ-H2AX) nelle cellule esposte laser. Da allora, l'approccio laser è stata impiegata in numerosi studi della DDR indotti da DSBs. Anche se potente e popolare, e la fonte di immagini di immunofluorescenza drammatiche, va notato che nella maggior parte degli esperimenti l'intensità del laser viene regolata in modo da produrre risultati osservabili, senza preoccupazione per l'identità della lesione,densità, o spaziatura. In effetti, può essere difficile fare queste stime. Così essi sono in gran parte ignorati, nonostante la molteplicità delle lesioni introdotte nel DNA da laser 5. Ciò contribuisce a molte contraddizioni nella letteratura 6.
In contrasto DSB, la maggior parte delle modificazioni chimiche del DNA non stimolano la formazione di foci discreta di proteine DDR. Questo è importante alla luce della nostra attuale comprensione delle frequenze lesione. È stato stimato che le cellule umane in coltura incorrere ben 50 DSBs per ciclo cellulare, formati principalmente durante la fase S 7, 8, 9. Meno sono formate in cellule non proliferanti. Ciò contrasta con il numero di perdite nucleobase o eventi di modifica, che sono nell'ordine delle decine di migliaia per cellula / giorno 1, 10. Così, sappiamo di più diDDR indotta da eventi che sono relativamente rare, e molto meno di quelli indotti dalla elica distorsione lesioni, che complessivamente sono molto più comuni.
Per affrontare domande circa la risposta cellulare al modificazioni covalenti di DNA genomico, abbiamo voluto lavorare con un'elica distorcere addotto del DNA che ha avuto l'attività DDR induzione intrinseca. Inoltre, per facilitare la progettazione sperimentale e interpretazione che sono interessati una struttura la cui introduzione potrebbe essere controllato rispetto al tempo ed era suscettibile di visualizzazione. Di conseguenza, abbiamo sviluppato una strategia basata su psoraleni. Psoraleni sono ben caratterizzati intercalanti del DNA fotoattivi favorendo 5' TA: AT siti. A differenza di altri agenti reticolanti quali mostarde azotate e mitomicina C (MMC) non sono DNA reattivi meno esposta a onde lunghe luce UV (UVA). Le molecole intercalate reagiscono con basi timina su filamenti opposti per produrre elica distorsione reticolazioni interstrand (ICL) 11. Con la psoralen trimetil utilizzato nei nostri esperimenti maggior parte dei prodotti sono ICL, relativamente pochi monoadducts vengono generati (meno del 10%), 12 e reticola intraelicoidali tra basi adiacenti su un filo non si formano. Perché sono potenti blocchi di replicazione e la trascrizione, psoraleni e altri agenti di reticolazione, come cis-platino e MMC, sono comunemente utilizzati in chemioterapia. Così psoralen abilitato studi che hanno seguito l'attivazione del DDR da una struttura distorsione elica, e anche fornito informazioni sulla risposta cellulare ad un composto con importanza clinica.
Abbiamo sintetizzato un reagente in cui trimetil psoraleni era legato alla digossigenina (DIG), uno steroli vegetali non trovato nelle cellule di mammifero e spesso usato come immunotag. Il requisito di fotoattivazione consente localizzazione dalla luce laser (365 nm) di ICLs psoraleni in ROI definita nei nuclei nelle cellule viventi. Questi possono essere visualizzati immunofluorescence contro il tag Dig. La riparazione del DNA e le proteine DDR apparsi nelle strisce di laser localizzati ICL 13, 14.
DDR attivato dalle intensità laser elevate utilizzate per produrre DSB potrebbe essere causa di danni isolati o cluster 15, 16. Di conseguenza, la pertinenza dei risultati di questi esperimenti presenti in natura, lesioni presenti a concentrazioni molto più basse, è incerto. Per far fronte a domande simili sulla frequenza addotto psoraleni e spaziatura in DNA, abbiamo approfittato della tecnologia in fibra DNA 17 e puntini immunoquantum. punti quantici sono molto maggiori coloranti fluorescenti e non sono sbiancati dall'esposizione alla luce. Così essi sono spesso utilizzati per l'imaging singola molecola 18, un'applicazione per cui coloranti fluorescenti sono sufficientemente brillante. fibre di DNA individuali possono essere allungati su gscivoli lass e possono essere visualizzati mediante immunofluorescenza contro analoghi nucleosidici incorporati durante l'incubazione prima alla cella raccolto. Abbiamo trattato cellule con Dig-psoralene e esposti ROI fino micro laser irradiazione. Fibre sono state preparate dalle cellule e singoli addotti Dig-psoralene potrebbe essere visualizzato con i puntini immunoquantum. Esponendo le cellule ad analoghi nucleosidici per tempi relativamente brevi (20-60 min) permette la visualizzazione dei tratti di replica in prossimità del laser localizzato ICL.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnologia di localizzazione laser richiede l'uso di cellule aderenti con nuclei che sono visibili in microscopia in campo chiaro. Abbiamo cercato di attaccare le cellule non aderenti, quali linfociti primari o cellule coltivate debolmente aderenti come AD293, alla superficie di vetro con preparazioni adesive cella come polilisina o collagene, o miscele più complesse. Anche se questi trattamenti possono legarsi alle cellule di superficie, troviamo che essi rimangono generalmente arrotondata che rende molto diffi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) e il Fondo di ricerca Anemia di Fanconi.
Materials
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100ml | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
Referencias
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