A 5-ماك دوت بلوت الفحص تحديد مستوى الحمض النووي ميثيلاتيون من تشوندروسيت التفرق<em> في المختبر</em
Summary
نقدم طريقة لقياس مثيلة الحمض النووي على أساس 5-ميثيلسيتوسين (5-مك) نقطة لطخة. لقد حددنا مستويات 5-مك خلال ديدفيرنتياتيون غضروفي. ويمكن استخدام هذه التقنية البسيطة لتحديد بسرعة النمط الظاهري غضروفي في علاج إسي.
Abstract
و ديديفرنتياتيون من غضروفية هيالين في غضروفية الليفية غالبا ما يرافق التوسع أحادي الطبقة من غضروفية في المختبر . ويعتبر مستوى مثيلة الحمض النووي العالمي من غضروفية لتكون علامة بيولوجية مناسبة لفقدان النمط الظاهري غضروفي. ومع ذلك، فإن النتائج التي تستند إلى أساليب تجريبية مختلفة يمكن أن تكون غير متناسقة. ولذلك، فمن المهم لوضع طريقة دقيقة وبسيطة وسريعة لتحديد مستويات الحمض النووي العالمية خلال ديدفيرنتياتيون غضروفي.
تعتمد تقنيات تحليل المثيلة الحالية على نطاق الجينوم إلى حد كبير على تسلسل الجينوم ثنائي الكبريت. بسبب تدهور الحمض النووي أثناء تحويل ثنائي الكبريت، هذه الطرق تتطلب عادة حجم عينة كبيرة. وتشمل الأساليب الأخرى المستخدمة لتحديد مستويات مثيلة الحمض النووي العالمية عالية الأداء اللوني السائل (هبلك). ومع ذلك، يتطلب هبلك هضم كامل من الحمض النووي الجيني. بالإضافة إلى ذلك، فإن ارتفاع تكلفة باهظة من هبلك فيسترومنتس حدود تطبيق هبلك على نطاق أوسع.
في هذه الدراسة، تم استخراج الحمض النووي الجيني (غنا) من تشوندروسيتس الإنسان مثقف مع عدد متفاوت من الممرات. تم الكشف عن مستوى مثيلة غنا باستخدام مقايسة محددة نقطة لطخة مقايسة. في هذا النهج نقطة وصمة عار، ورصدت خليط غنا تحتوي على الحمض النووي ميثليته ليتم الكشف عنها مباشرة على غشاء N + كنقطة داخل نمط قالب دائري رسمها سابقا. وبالمقارنة مع غيرها من نهج النشاف القائم على الرحل الكهربائي وغيرها من إجراءات النشاف المعقدة، وطريقة نقطة وصمة عار يوفر وقتا كبيرا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن البقع نقطة الكشف عن مستوى مثيلة الحمض النووي الشامل باستخدام المتاحة تجاريا 5-مك الأجسام المضادة. وجدنا أن مستوى مثيلة الحمض النووي تختلف بين الثقافات الفرعية أحادي الطبقة، وبالتالي يمكن أن تلعب دورا رئيسيا في ديفيدفيرنتياتيون غضروفي. و 5-مك نقطة لطخة هو وسيلة موثوقة وبسيطة وسريعة للكشف عن مستوى مثيلة الحمض النووي العام ل إيفالواتالنمط الظاهري غضروفي.
Introduction
زرع خلية غضروفي الذاتي (إسي) هو جديد نسبيا، للدولة من بين الفن الإجراء لعلاج عيوب الغضروف المفصلي 1 ، 2 . واحدة من الخطوات الحاسمة في إسي هو التضخيم من غضروفية عن طريق ثقافة أحادي الطبقة في المختبر . خلال التضخيم، غضروفية هيالين تفقد بسهولة النمط الظاهري وتصبح ديديفيرنتياتد، وهو أمر غير مرغوب فيه لعلاج إسي 3 ، 4 . لتحسين نتيجة العلاج إسي، ينبغي تحديد مدى ديفيدفيرنتياتيون غضروفية قبل إعادة الزرع. لا بد من إنشاء وسيلة اقتصادية وسريعة لتحديد حالة غضروفية. في الآونة الأخيرة، وقد اجتذب الارتباط بين مثيلة الحمض النووي و غوندروسيت ديفيدفيرنتياتيون الكثير من الاهتمام 4 ، 5 ، 6 . مثيلة الحمض النووي هي عملية من قبل ويتم إضافة مجموعات الميثيل إش إلى الحمض النووي، مما أدى إلى تحويل بقايا السيتوزين إلى 5-ميثيلسيتوسين (5-مك).
لتوضيح بيولوجيا مثيلة الحمض النووي في ديدفيرنتياتيون غضروفي، الخطوة الأولى هي لتقييم مستوى مثيلة الحمض النووي من غضروفية، والتي حتى الآن أثبتت تحديا. تسلسل الجينوم ثنائي السلفيت هو الأكثر استخداما على نطاق واسع لتحليل مثيلة الحمض النووي 7 ، 8 . في هذا الفحص، تحويل ثنائي الكبريت يسبب تدهور الحمض النووي، وبالتالي يجب توفير كمية كبيرة من العينة للفحص. أيضا، عالية الأداء اللوني السائل (هبلك) وقد استخدمت لقياس مستويات الحمض النووي العالمية 9 ، 10 . ومع ذلك، يتطلب تحليل هبلك الهضم الحمض النووي الجيني. وعلاوة على ذلك، مطلوب أدوات تجريبية متقدمة ومكلفة. لذلك، بالإضافة إلى التكلفة العالية، وهذه الإجراءات التجريبية هي سلبيات الوقتuming. وأصبحت الأجسام المضادة المضادة 5-ماك متاحة تجاريا الآن، مما خلق إمكانية للنشاف المناعي من الحمض النووي الجيني التي تحتوي على 5 ميكروغرام من الجينومات المعقدة.
في هذا التقرير، نحن استخراج الحمض النووي الجيني من غضروفية نمت في سلسلة من الثقافات أحادي الطبقة. استخدمنا فحص نقطة وصمة عار لتقييم محتوى 5-مك في غضروفية الإنسان مع أعداد مختلفة من الممرات. وجدنا أن المحتوى 5-مك قد زاد في غضروفية ديديفيرنتياتد عالية مقارنة مع غضروفية مع انخفاض الدرجة ديفيدفيرنتياتيون. بالإضافة إلى ذلك، حددنا العلاقة بين حالة التباين ومستويات 5-ماك. وأخيرا، أبلغنا أن التغييرات في المحتوى 5-مك كانت مرتبطة النمط الظاهري غضروفي. ولذلك، فإن 5-مك نقطة وصمة عار الفحص هو وسيلة موثوقة وبسيطة وسريعة للكشف عن مستوى مثيلة الحمض النووي في غضروفية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تشوندروسيت ديديفرنتيتياتيون في المختبر يضعف بشدة نتيجة إسي في علاج الغضروف إصلاح عيب 11 ، 12 . لتحسين نتيجة إسي، فمن الأهمية بمكان لتجنب استخدام غضروفية ديديفرنتياتد 13 . وقد اقترحت الدراسات أن مستوى الحمض النووي العام …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل المنح التالية: مؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (رقم 81572198؛ رقم 81260161؛ رقم 81000460)؛ مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة قوانغدونغ، الصين (رقم 2015A030313772)؛ الصين مؤسسة العلوم ما بعد الدكتوراه بتمويل المشروع (رقم 2013M530385)؛ مؤسسة البحوث الطبية بمقاطعة قوانغدونغ، الصين (رقم A2016314)؛ شنتشن للعلوم والتكنولوجيا المشاريع (رقم JCYJ20160301111338144؛ رقم JSGG20151030140325149؛ رقم JSGG20140519105550503؛ رقم JJYZ20130412153906739؛ رقم JCYJ20140414170821160؛ رقم JCYJ20140414170821200).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline(PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of |
| Ca2+/Mg2+ | |||
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25%Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1%Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Names | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Cell Strainer(40μm nylon） | FALCON Inc. | 352340 | |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
Referencias
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
- Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
- Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
- Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , (2016).
- Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
- Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
- Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
- Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
- Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
- Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
- Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
- Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
- Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
