Se presenta un método para cuantificar la metilación del ADN basado en la 5-mctilcitosina (5-mC) dot blot. Se determinaron los niveles de 5-mC durante la desdiferenciación de condrocitos. Esta técnica simple podría utilizarse para determinar rápidamente el fenotipo de condrocito en el tratamiento de ACI.
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Artículo de método
Un ensayo de transferencia de puntos de 5 mC cuantificando el nivel de metilación de ADN de la distredenciación de condrocitos
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Resumen
Resumen
La desdiferenciación de condrocitos hialinos en condrocitos fibroblásticos acompaña a menudo la expansión monocapa de condrocitos in vitro . El nivel global de metilación del ADN de los condrocitos se considera un biomarcador adecuado para la pérdida del fenotipo de los condrocitos. Sin embargo, los resultados basados en diferentes métodos experimentales pueden ser inconsistentes. Por lo tanto, es importante establecer un método preciso, simple y rápido para cuantificar los niveles globales de metilación del ADN durante la desdiferenciación de los condrocitos.
Las técnicas actuales de análisis de metilación en todo el genoma se basan en gran medida en la secuenciación genómica del bisulfito. Debido a la degradación del ADN durante la conversión de bisulfito, estos métodos requieren típicamente un gran volumen de muestra. Otros métodos utilizados para cuantificar los niveles globales de metilación del ADN incluyen la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Sin embargo, la HPLC requiere digestión completa del ADN genómico. Además, el costo prohibitivo de la HPLC enLimita la aplicación más amplia de HPLC.
En este estudio, el ADN genómico (gDNA) se extrajo de condrocitos humanos cultivados con un número variable de pasajes. El nivel de metilación de gDNA se detectó usando un ensayo dot blot de metilación específica. En este enfoque dot blot, una mezcla de gDNA que contenía el ADN metilado a detectar se colocó directamente sobre una membrana N + como un punto dentro de un patrón de plantilla circular previamente dibujado. Comparado con otros enfoques basados en electroforesis en gel y otros procedimientos de transferencia de material complejos, el método dot blot ahorra tiempo significativo. Además, las manchas de puntos pueden detectar el nivel de metilación del ADN global usando un anticuerpo de 5 mC comercialmente disponible. Encontramos que el nivel de metilación del ADN difería entre los subcultivos monocapa, y por lo tanto podría desempeñar un papel clave en la desdiferenciación condrocitos. El punto blot de 5 mC es un método confiable, simple y rápido para detectar el nivel general de metilación del ADN a evaluarE fenotipo de condrocito.
Introducción
El implante autólogo de los condrocitos (IAC) es un procedimiento relativamente nuevo y de última generación para tratar los defectos del cartílago articular 1 , 2 . Uno de los pasos cruciales en ACI es la amplificación de condrocitos a través de cultivo monocapa in vitro . Durante la amplificación, los condrocitos hialinos pierden fácilmente su fenotipo y se desdiferencian, lo cual es indeseable para el tratamiento con ACI 3 , 4 . Para optimizar el resultado del tratamiento con ACI, se debe determinar la extensión de la desdiferenciación de ....
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Protocolo
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Humana del Segundo Hospital Popular de Shenzhen.
1. Colección de Tejido Articular Humano y Cultura de Condrocitos
- Preparación de materiales
- Preparar el medio de águila modificada de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina. Preparar 1 mg / ml de colagenasa II, 0,25% de tripsina-EDTA, solución salina tamponada con fosfato (PBS) y un colador celular (40 μm de nylon).
- Colección de tejido del cartílago articular humano
- Aislar el cartílago articular de las articu....
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Resultados
Los condrocitos se cultivaron en una monocapa hasta el paso 6 (P6). Los condrocitos mostraron cambios fenotípicos progresivos con pases sucesivos del cultivo monocapa. La morfología de los condrocitos P0 era ronda, mientras que las células se convirtió muy pellizcado y aplanado con pases sucesivos hasta P6 ( Figura 1 ]. Este cambio de morfología es típico del proceso de desdiferenciación de condrocitos. Mientras tanto, los resultados del mapa de calor indicaron que el ni.......
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Discusión
Desdiferenciación de condrocitos in vitro compromete gravemente el resultado de la ACI en el tratamiento de la reparación de defectos del cartílago [ 11 , 12] . Para optimizar el resultado ACI, es crucial evitar el uso de condrocitos desdiferenciados [ 13] . Los estudios han sugerido que el nivel general de metilación del ADN está asociado con la extensión de la desdiferenciación de los condrocitos 4 .......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones siguientes: Fundación de Ciencias Naturales de China (No. 81572198; No. 81260161; No. 81000460); Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong, China (No. 2015A030313772); Proyecto financiado por la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (No. 2013M530385); La Fundación de Investigación Médica de la provincia de Guangdong, China (No. A2016314); Proyectos de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco Inc. | 11965 y ndash; 092 | Cálido en 37 ° C Baño de agua antes de usar |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, libre de Ca2+/Mg2+ |
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25% Tripsina/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| Penicilina-estreptomicina al 1% | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Cloroformo | Mallinckrodt | 4440 | |
| Alcohol isoamílico | Sigma | I-3643 | |
| Fenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinasa K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| Tampón TAE | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Agua Destilada | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | ||
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Colagenasa, Tipo II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Plato Falcon de 100 mm | Tubos | ||
| Corning | TPP AG | 91050 | Esterilizado por rayos gamma |
| Centrífuga de alta velocidad | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Incubadora de células de dióxido de carbono | Thermo scientific | 3111 | |
| Sistema de análisis de quimioimagen | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
Referencias
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Au....
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