Un dosage de point à 5 mC Quantification du niveau de méthylation d'ADN de la Dedifférenciation des chondrocytes<em> In Vitro</em
Summary
Nous présentons une méthode pour quantifier la méthylation de l'ADN en fonction de la 5-méthylcytosine (5-mC) dot blot. Nous avons déterminé les niveaux de 5 mC pendant la dédifférenciation des chondrocytes. Cette technique simple pourrait être utilisée pour déterminer rapidement le phénotype des chondrocytes dans le traitement ACI.
Abstract
La dédifférenciation des chondrocytes hyalins dans les chondrocytes fibroblastiques accompagne souvent l'expansion monocouche de chondrocytes in vitro . Le niveau global de méthylation de l'ADN des chondrocytes est considéré comme un biomarqueur approprié pour la perte du phénotype des chondrocytes. Cependant, les résultats basés sur différentes méthodes expérimentales peuvent être incohérents. Par conséquent, il est important d'établir une méthode précise, simple et rapide pour quantifier les niveaux globaux de méthylation de l'ADN pendant la dédifférenciation des chondrocytes.
Les techniques actuelles d'analyse de la méthylation à l'échelle du génome reposent largement sur le séquençage génomique des bisulfites. En raison de la dégradation de l'ADN pendant la conversion du bisulfite, ces procédés nécessitent généralement un volume d'échantillon important. D'autres méthodes utilisées pour quantifier les niveaux globaux de méthylation de l'ADN comprennent la chromatographie liquide haute performance (HPLC). Cependant, la HPLC nécessite une digestion complète de l'ADN génomique. En outre, le coût prohibitif élevé de la HPLC dansLes instruments limitent l'application plus large de HPLC.
Dans cette étude, l'ADN génomique (ADNg) a été extrait de chondrocytes humains cultivés avec un nombre variable de passages. Le niveau de méthylation de l'ADNc a été détecté en utilisant un dosage de transfert de point spécifique à la méthylation. Dans cette approche dot blot, un mélange d'ADNg contenant l'ADN méthylé à détecter a été repéré directement sur une membrane N + en tant que point à l'intérieur d'un modèle de modèle circulaire préalablement étiré. Par rapport à d'autres approches d'imprégnation à base d'électrophorèse sur gel et d'autres procédures complexes de transfert, la méthode de transfert de points enregistre un temps important. En outre, les transferts de points peuvent détecter le niveau global de méthylation de l'ADN en utilisant un anticorps 5-mC disponible dans le commerce. Nous avons constaté que le niveau de méthylation de l'ADN différait entre les sous-cultures monocouches et pouvait donc jouer un rôle clé dans la dédifférenciation des chondrocytes. Le point blot 5 mC est une méthode fiable, simple et rapide pour détecter le niveau général de méthylation de l'ADN pour évaluerPhénotype chondrocyte.
Introduction
L'implantation de chondrocytes autologue (ACI) est une procédure relativement nouvelle et à la fine pointe de la technique pour traiter les défauts du cartilage articulaire 1 , 2 . L'une des étapes cruciales de l'ACI est l'amplification des chondrocytes par culture monocouche in vitro . Pendant l'amplification, les chondrocytes hyalines perdent facilement leur phénotype et deviennent dédifférenciés, ce qui n'est pas souhaitable pour le traitement ACI 3 , 4 . Pour optimiser le résultat du traitement ACI, l'étendue de la dédifférenciation des chondrocytes devrait être déterminée avant la replantation. Il est impératif d'établir un moyen économique et rapide de déterminer le statut des chondrocytes. Récemment, l'association entre la méthylation de l'ADN et la dédifférenciation des chondrocytes a attiré beaucoup d'attention 4 , 5 , 6 . La méthylation de l'ADN est un processus par whDes groupes méthyle sont ajoutés à l'ADN, ce qui entraîne la conversion des résidus de cytosine en 5-méthylcytosine (5-mC).
Pour élucider la biologie de la méthylation de l'ADN dans la dédifférenciation des chondrocytes, la première étape consiste à évaluer le niveau de méthylation de l'ADN des chondrocytes qui, jusqu'à présent, se sont révélés difficiles. Le séquençage génomique du bisulfite est la technique la plus utilisée pour analyser la méthylation de l'ADN 7 , 8 . Dans ce dosage, la conversion de bisulfite provoque une dégradation de l'ADN, et donc une quantité substantielle d'échantillon doit être fournie pour l'essai. En outre, la chromatographie liquide haute performance (HPLC) a été utilisée pour quantifier les niveaux globaux de méthylation de l'ADN 9 , 10 . Cependant, l'analyse HPLC nécessite une digestion par l'ADN génomique. En outre, des instruments expérimentaux avancés et coûteux sont nécessaires. Par conséquent, en plus du coût élevé, ces procédures expérimentales sont des contre-inconvénientsUming. Les anticorps anti-5-mC sont maintenant disponibles dans le commerce, ce qui a créé la possibilité d'un transfert immunologique d'ADN génomique contenant 5 mC à partir de génomes complexes.
Dans ce rapport, nous avons extrait l'ADN génomique des chondrocytes cultivés dans une série de cultures monocouches. Nous avons utilisé un test de point blot pour évaluer le contenu de 5 mC dans les chondrocytes humains avec différents nombres de passages. Nous avons constaté que le contenu de 5 mC était augmenté dans les chondrocytes fortement dédifférenciés par rapport aux chondrocytes à dédifférenciation de bas grade. En outre, nous avons identifié une relation entre le statut de dédifférenciation et les niveaux de 5 mC. Enfin, nous avons signalé que les changements dans le contenu de 5 mC étaient associés au phénotype des chondrocytes. Par conséquent, l'essai de transfert de point de 5 mC est une méthode fiable, simple et rapide pour détecter le niveau de méthylation de l'ADN dans les chondrocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La dédifférenciation des chondrocytes in vitro compromet sérieusement le résultat de l'ACI dans le traitement de la réparation des défauts du cartilage 11 , 12 . Pour optimiser les résultats ACI, il est crucial d'éviter l'utilisation de chondrocytes dédifférenciés 13 . Des études ont suggéré que le niveau général de méthylation de l'ADN est associé à l'étendue de la dédifférenciation des …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes: Fondation des sciences naturelles de la Chine (n ° 81572198; n ° 81260161; n ° 81000460); Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong, Chine (n ° 2015A030313772); Projet financé par la Fondation canadienne de la science postdoctorale (no 2013M530385); La Fondation de recherche médicale de la province de Guangdong, en Chine (no A2016314); Projets de science et de technologie de Shenzhen (n ° JCYJ20160301111338144; N ° JSGG20151030140325149; N ° JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; N ° JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline(PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of |
| Ca2+/Mg2+ | |||
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25%Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1%Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Names | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Cell Strainer(40μm nylon） | FALCON Inc. | 352340 | |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
Referencias
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
- Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
- Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
- Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , (2016).
- Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
- Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
- Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
- Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
- Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
- Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
- Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
- Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
- Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
