Vorbereitung und<em> In Vitro</em> Charakterisierung von Magnetized miR-modifizierten Endothelzellen
Summary
Dieses Manuskript beschreibt die effiziente, nicht-virale Abgabe von miR-Zellen durch einen PEI / MNP-Vektor und ihre Magnetisierung an Endothelzellen. Somit kann zusätzlich zu genetischer Veränderung, ermöglicht dieser Ansatz für die magnetische Zellführung und MRI Nachweisbarkeit. Die Technik kann verwendet werden, um die Eigenschaften von therapeutischen Zellprodukten zu verbessern.
Abstract
Bis heute sind die verfügbaren chirurgischen und pharmakologischen Behandlungen für Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) sind begrenzt und oft palliativ. Zur gleichen Zeit, Gen- und Zelltherapien sind vielversprechende alternative Ansätze für eine CVD-Behandlung. Allerdings ist die breite klinische Anwendung der Gentherapie durch den Mangel an geeigneten Genabgabesysteme stark eingeschränkt. Die Entwicklung geeigneter Genübertragungsvektoren können, eine Lösung für die aktuellen Herausforderungen in der Zelltherapie bereitzustellen. Insbesondere bestehende Nachteile, wie begrenzte Effizienz und niedrige Zelleinlagerungen im Organe verletzt, konnte durch entsprechendes Zell – Engineering (dh genetische) vor der Transplantation überwunden werden. Das dargestellte Protokoll beschreibt die effiziente und sichere vorübergehende Modifikation von Endothelzellen ein Polyethylenimin superparamagnetischen Nanopartikel (PEI / MNP) -basierten Auslieferungsvektor verwendet wird. Außerdem werden der Algorithmus und Methoden zur Zellcharakterisierung definiert. Die erfolgreiche intracelluLAR Lieferung von microRNA (du) in menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) hat, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinflussen, Funktionalität oder die interzelluläre Kommunikation erzielt worden. Darüber hinaus wurde dieser Ansatz eine starke funktionelle Wirkung in eingeführten exogen ich verursachen unter Beweis gestellt. Wichtig ist, gewährleistet die Anwendung dieser MNP-basierte Vektorzelle Magnetisierung, mit Möglichkeiten des magnetischen Ausrichtung und nicht-invasiven MRI-Tracing begleitet. Dies kann eine Grundlage für die magnetisch geführt wird, gentechnisch hergestellten Zelltherapeutika bereitzustellen, die nicht-invasiv mit MRI überwacht werden kann.
Introduction
Gen- und Zelltherapie sind leistungsfähige Werkzeuge, die das Potenzial haben, um die aktuellen Herausforderungen in CVD-Behandlung zu lösen. Trotz der Tatsache , dass diese beiden Ansätze derzeit in klinischen Studien getestet werden, sind sie noch nicht bereit für eine breite klinische Anwendung 1. Bemerkenswert ist, ein gemeinsames Konzept für die Herausforderungen der Gen- und Zelltherapie zu bekämpfen ist multifunktional Genabgabevektoren geeignet für die klinische Anwendung zu entwickeln. Der Mangel an sicheren und effizienten Genabgabesysteme ist das Hauptanliegen der Gentherapie. Zur gleichen Zeit, die gentechnische Veränderung von Zellprodukten vor der Transplantation konnte die schweren Herausforderungen der Zelltherapie, wie geringe Effizienz (zB im Herzfeld, nur ca. 5% der funktionellen Verbesserung erreichte nach Stammzelltransplantation überwunden 1 ) und schlechte Retention / Verpflanzung an der Stelle der Verletzung (dh fällt Zellbindung unter von 5 bis 10% innerhalb von Minuten bis Stunden post-Anwendung, unabhängig vom Applikationsweg 2, 3, 4).
Bisher überschreiten virale Vektoren stark nicht-virale Systeme in Bezug auf Effizienz, die in ihrer breiteren Anwendung in klinischen Studien (~ 67%) 5 geführt hat. Allerdings trägt virales Vehikel ernsthafte Risiken, wie Immunogenität (und die nachfolgende Entzündungsreaktion mit schweren Komplikationen), Onkogenizität und Einschränkungen in der Größe des durch genetische Material 6. Aufgrund dieser Sicherheitsbedenken und die hohen Kosten der Produktion viraler Vektor, ist die Verwendung von nicht-viralen Systemen bevorzugt in bestimmten Fällen 7, 8. Es ist besonders geeignet für Erkrankungen , die transient genetische Korrektur, wie beispielsweise die Expression von Wachstumsfaktoren erfordern Steuerung der Angiogenese (zB für die CVD – Behandlung) oder die delivery von Impfstoffen.
In unserer Gruppe wurde ein Abgabesystem durch die Kombination von verzweigtem 25 kDa-Polyethylenimin (PEI) und superparamagnetische Eisenoxid – Nanopartikel (MNP) miteinander verbunden ist durch Biotin-Streptavidin – Wechselwirkung 9 ausgelegt. Dieser Vektor ist ein mögliches Instrument für die gentechnische Veränderung von Zellen, so dass für ihre gleichzeitige Magnetisierung vor der Transplantation. Letzteres stellt eine Basis für die magnetische Orientierung / Retention, die heutzutage besonders vielversprechend, da die erweiterte Targeting Techniken erfolgreich 10 entwickelt. Zudem 12 die resultierenden magnetisch ansprechenden Zellen , die das Potential haben , nicht-invasiv durch Magnetresonanztomographie (MRI) oder Magnetic Particle Imaging 11, überwacht zu werden.
Im Fall des PEI / MNP-Vektor, stellt sicher, Polyamin-Kondensations Nukleinsäure- und somit Schutz vor abbauenden Faktor s, Vektor – Internalisierung in Zellen und endosomalen 5 entkommen. Die MNP ergänzen die Eigenschaften von PEI, nicht nur in Bezug auf die magnetische Orientierung, sondern auch durch die bekannte PEI Toxizität reduzieren 7, 13, 14. Zuvor in Bezug auf die Abgabeeffizienz (dh pDNA und miRNA) und Sicherheits PEI / MNP Vektor Eigenschaften wurden eingestellt durch Fibroblasten und humanen mesenchymalen Stammzellen , 15, 16 verwendet wird .
In diesem Manuskript wird ein ausführliches Protokoll zur Anwendung von PEI / MNP zur Erzeugung von miRNA-modifizierten Zellen wird 17 beschrieben. Zu diesem Zweck werden HUVECs verwendet und ein etabliertes Modell für die de – vitro – Angiogenese darstellen. Sie sind schwierig zu transfizieren und sind anfällig für toxische Einflüsse 18, 19,ass = "xref"> 20. Zusätzlich stellen wir einen Algorithmus solche Zellen in vitro zu bewerten, einschließlich ihrer Ausrichtung, die interzelluläre Kommunikation, und MRI – Erkennung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Herstellung von gentechnisch veränderten Zellen, beladen mit superparamagnetische Nanopartikel für ihre weiteren magnetisch gesteuerte Führung wird in dem aktuellen Protokoll dargestellt. Die erfolgreiche Anwendung dieser Strategie ermöglicht die Auflösung einiger Schwierigkeiten der Zelltherapie, wie geringe Retention und schlechte Einpflanzung in dem verletzten Bereich 2, 3, 4, durch ein anzielbare Zellprodukt zur Tr…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten, dass beim Erwerb von TEM-Aufnahmen von gefilterten superparamagnetische Nanopartikel und bei der Durchführung ihrer Röntgenanalyse G. Fulda (Elektronenmikroskopie Zentrum, Universität Rostock, Deutschland) für die technische Unterstützung. Die Arbeit an der RTC Rostock durchgeführt wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung Deutschland (FKZ 0312138A, FKZ 316159 und VIP + 03VP00241) und dem Staat Mecklenburg-Vorpommern mit EU-Strukturfonds (ESF / IV-WM-B34- unterstützt 0030/10 und ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) und von der DFG (DA 1296-1), die Damp-Foundation und der deutschen Herz Foundation (F / 01/12). Frank Wiekhorst wurde von dem EU FP7 Forschungsprogramm "Nanomag" FP7-NMP-2013-LARGE-7 unterstützt.
Materials
| PEI 25 kDa | Sigma Aldrich | 408727 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | Containing Sephadex G-25 Medium |
| Ninhydrin Reagent solution 2% | Sigma Aldrich | 7285 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| Microplate reader Model 680 | Bio-Rad | ||
| Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega | Z5481 | |
| Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45µm |
| Libra 120 transmission electron microscope | Zeiss | Acceleration Voltage 120KV | |
| Sapphire X-ray detector | EDAX-Amatek | ||
| Cell culture plastic | TPP | ||
| NHS-Esther Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-31 | |
| NHS-Esther Atto 488 | ATTO-TEC GmbH | AD 488-31 | |
| Cy5 miRNA Label IT kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
| Biotin Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
| Collagense Type IV Gibco | Thermo Scientific | 17104019 | |
| Endothelial growth medium, EGM-2 | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| anti-PECAM-1 antibody | Santa Cruz | sc-1506 | |
| MS MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Scientific | L10119 | |
| Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control | Thermo Scientific | AM17120 | "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript |
| Pre-miR miRNA Precursor Molecules – Negative Control | Thermo Scientific | AM17110 | "scr-miR" in the manuscript |
| Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor | Thermo Scientific | AM10916 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | 4% solution in PBS |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 | |
| NucleoSpin RNA isolation Kit | Machery-Nagel | 740955 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Scientific | AM1560 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4366596 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4368814 | |
| hsa-miR-92a TaqMan assay | Thermo Scientific | 000431 | Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU |
| FastGene Taq Ready Mix | Nippon Genetics | LS27 | |
| ITGA5 TaqMan assay | Thermo Scientific | Hs01547673_m1 | |
| RNU6B TaqMan assay | Thermo Scientific | 001093 | |
| 18S rRNA Endogenous Control | Thermo Scientific | 4333760F | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | ||
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| 7.1 Tesla animal MRI system | Bruker Corporation | A7906 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH) | |
| MPS device | Bruker Biospin | ||
| Matlab software | Mathworks | ||
| Ring Neodym Magnet | magnets4you GmbH | RM-10x04x05-G | ø 10 mm; remanescence is ~1.3T, coercivity ≥ 955 kA/m |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Scientific | C10340 | |
| FluorSave Reagent | Merck | 345789 | |
| Ultrasonic bath | Bandelin electronic | Type: RK 100 SH |
Referencias
- Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
- Zeng, L., Hu, Q., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
- Terrovitis, J., Lautamäki, R., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J Am Coll Cardiol. 54 (17), 1619-1626 (2009).
- Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy – Principles and Challenges. , (2015).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Adv Biomed Res. 1, 27 (2012).
- Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 15 (8), 541-555 (2014).
- Chira, S., Jackson, C. S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
- Li, W., Ma, N., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. J Gene Med. 10 (8), 897-909 (2008).
- Muthana, M., Kennerley, A. J., et al. Use of magnetic resonance targeting to direct cell therapy to target sites in vivo. Nat Commun. 6, 1-11 (2013).
- Zheng, B., von See, M. P., et al. Quantitative Magnetic Particle Imaging Monitors the Transplantation, Biodistribution, and Clearance of Stem Cells In Vivo. Theranostics. 6 (3), 291-301 (2016).
- Almstätter, I., Mykhaylyk, O., et al. Characterization of magnetic viral complexes for targeted delivery in oncology. Theranostics. 5 (7), 667-685 (2015).
- Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. , (2016).
- Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16023 (2016).
- Schade, A., Delyagina, E., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. Int J Mol Sci. 14 (6), 10710-10726 (2013).
- Delyagina, E., Schade, A., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), 999-1017 (2014).
- Voronina, N., Lemcke, H., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine. 12 (8), 2353-2364 (2016).
- Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
- Zhang, J., Wang, Z., Lin, W., Chen, S. Gene transfection in complex media using PCBMAEE-PCBMA copolymer with both hydrolytic and zwitterionic blocks. Biomaterials. 35 (27), 7909-7918 (2014).
- Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
- Moore, S., Stein, W. H. A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds. J Biol Chem. 211 (2), 907-913 (1954).
- Jones, D. L., Owen, A. G., Farrar, J. F. Simple method to enable the high resolution determination of total free amino acids in soil solutions and soil extracts. Soil Biol Biochem. 34 (12), 1893-1902 (2002).
- Kircheis, R., Wightman, L., et al. Polyethylenimine/DNA complexes shielded by transferrin target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther. 8 (1), 28-40 (2001).
- Green, N. M. A SPECTROPHOTOMETRIC ASSAY FOR AVIDIN AND BIOTIN BASED ON BINDING OF DYES BY AVIDIN. Biochem J. 94, 23 (1965).
- Haugland, R. P., You, W. W. Coupling of Antibodies with Biotin. Methods Mol Biol. 418, 13-23 (2008).
- Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology. J Microbiol Methods. 89 (1), 41-48 (2012).
- Andrade, &. #. 1. 9. 4. ;. L., Valente, M. A., Ferreira, J. M. F., Fabris, J. D. Preparation of size-controlled nanoparticles of magnetite. J Magn Magn Mater. 324 (10), 1753-1757 (2012).
- Barbaro, D., Di Bari, L., et al. Glucose-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles prepared by metal vapour synthesis are electively internalized in a pancreatic adenocarcinoma cell line expressing GLUT1 transporter. PLoS ONE. 10 (4), e0123159 (2015).
- Gaebel, R., Ma, N., et al. Patterning human stem cells and endothelial cells with laser printing for cardiac regeneration. Biomaterials. 32 (35), 9218-9230 (2011).
- Martín de Llano, J. J., Fuertes, G., Torró, I., García Vicent, C., Fayos, J. L., Lurbe, E. Birth weight and characteristics of endothelial and smooth muscle cell cultures from human umbilical cord vessels. J Transl Med. 7, 30 (2009).
- Bonauer, A., Carmona, G., et al. MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice. Science. 324 (5935), 1710-1713 (2009).
- Wang, W., Li, W., et al. Polyethylenimine-mediated gene delivery into human bone marrow mesenchymal stem cells from patients. J Cell Mol Med. 15 (9), 1989-1998 (2011).
- Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 98, 117-127 (2016).
- Cheng, K., Li, T. -. S., Malliaras, K., Davis, D. R., Zhang, Y., Marbán, E. Magnetic targeting enhances engraftment and functional benefit of iron-labeled cardiosphere-derived cells in myocardial infarction. Circ Res. 106 (10), 1570-1581 (2010).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. , A.3B.1-A.3B.2 (2001).
- Chorny, M., Alferiev, I. S., et al. Formulation and in vitro characterization of composite biodegradable magnetic nanoparticles for magnetically guided cell delivery. Pharm Res. 29 (5), 1232-1241 (2012).
- Poller, W., Löwa, N., et al. Magnetic Particle Spectroscopy Reveals Dynamic Changes in the Magnetic Behavior of Very Small Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles During Cellular Uptake and Enables Determination of Cell-Labeling Efficacy. J Biomed Nanotechnol. 12 (2), 337-346 (2016).
- Lobsien, D., Dreyer, A. Y., Stroh, A., Boltze, J., Hoffmann, K. T. Imaging of VSOP Labeled Stem Cells in Agarose Phantoms with Susceptibility Weighted and T2* Weighted MR Imaging at 3T: Determination of the Detection Limit. PLoS ONE. 8 (5), 1-10 (2013).
- Hernando, D., Kühn, J. -. P., et al. R2* estimation using "in-phase" echoes in the presence of fat: the effects of complex spectrum of fat. J Magn Reson Imaging. 37 (3), 717-726 (2013).
- Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -. M., Parak, W. J., De Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6 (5), 446-465 (2011).
- Robert, D., Kirkton, N. B. Genetic Engineering and Stem Cells: Combinatorial Approaches for Cardiac Cell Therapy. IEEE Eng Med Biol Mag. 27 (3), 85 (2008).
- Chen, Y., Wang, W., et al. Development of an MRI-visible nonviral vector for siRNA delivery targeting gastric cancer. Int J Nanomedicine. 7, 359-368 (2012).
- Diener, Y., Jurk, M., et al. RNA-based, transient modulation of gene expression in human haematopoietic stem and progenitor cells. Sci Rep. 5, 17184 (2015).
- Müller, P., Voronina, N., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem Cells Int. 2016, 1-16 (2016).
- Yang, H., Vonk, L. A., et al. Cell type and transfection reagent-dependent effects on viability, cell content, cell cycle and inflammation of RNAi in human primary mesenchymal cells. Eur J Pharm Sci. 53, 35-44 (2014).
- Chen, C. -. H., Sereti, K. -. I., Wu, B. M., Ardehali, R. Translational aspects of cardiac cell therapy. J Cell Mol Med. 19 (8), 1757-1772 (2015).
- Alaiti, M. A., Ishikawa, M., et al. Up-regulation of miR-210 by vascular endothelial growth factor in ex vivo expanded CD34+ cells enhances cell-mediated angiogenesis. J Cell Mol Med. 16 (10), 2413-2421 (2012).
- Landázuri, N., Tong, S., et al. Magnetic targeting of human mesenchymal stem cells with internalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Small. 9 (23), 4017-4026 (2013).
- Carenza, E., Barceló, V., et al. In vitro angiogenic performance and in vivo brain targeting of magnetized endothelial progenitor cells for neurorepair therapies. Nanomedicine. 10 (1), 225-234 (2014).
- Kyrtatos, P. G., Lehtolainen, P., et al. Magnetic Tagging Increases Delivery of Circulating Progenitors in Vascular Injury. JACC Cardiovasc Interv. 2 (8), 794-802 (2009).
- Huang, Z., Shen, Y., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 149 (2013).
- Wu, X., Tan, Y., Mao, H., Zhang, M. Toxic effects of iron oxide nanoparticles on human umbilical vein endothelial cells. Int J Nanomedicine. 5, 385-399 (2010).
- Soenen, S. J. H., Nuytten, N., De Meyer, S. F., De Smedt, S. C., De Cuyper, M. High Intracellular Iron Oxide Nanoparticle Concentrations Affect Cellular Cytoskeleton and Focal Adhesion Kinase-Mediated Signaling. Small. 6 (7), 832-842 (2010).
- Cheng, K., Malliaras, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell Transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
- Vandergriff, A. C., Hensley, T. M., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).
