这个手稿描述的miR的有效的,非病毒递送通过PEI / MNP矢量和它们的磁化与内皮细胞。因此,除了遗传修饰,该方法允许用于磁性细胞的指导和MRI可检测性。该技术可以被用来改善的治疗性细胞产品的特性。
迄今为止,用于治疗心血管疾病的可用外科和药物治疗(CVD)是有限的,经常姑息。与此同时,基因和细胞的疗法可用于CVD处理极有希望的替代方法。然而,基因治疗的广泛临床应用极大地受到缺乏合适的基因递送系统的限制。的合适的基因递送载体的发展可以提供解决方案,以在细胞疗法目前的挑战。特别是,现有的缺点,例如,在受伤器官限定的效率和低的细胞保留,可以通过适当的细胞工程来克服移植( 即遗传)之前进行。所提出的协议描述了使用聚乙烯亚胺的超顺磁性纳米颗粒(PEI / MNP)系递送载体的内皮细胞的有效且安全的瞬时变形。此外,算法和细胞表征方法定义。成功intracellu微RNA(MIR)到人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的拉尔递送已经在不影响细胞生存力,功能,或者细胞间的通信被实现。此外,这种方法被证明会导致导入的外源的miR强大的功能效果。重要的是,这种基于MNP-矢量的应用确保细胞磁化,伴随磁靶向和非侵入性的MRI跟踪的可能性。这可以提供对于可以非侵入性地监测与MRI磁性引导,遗传工程细胞疗法的基础。
基因和细胞治疗是必须要解决的CVD处理当前挑战的潜在的强大工具。尽管这两种方法,目前正在临床试验,他们还没有准备好广泛的临床应用1。值得注意的是,以解决基因和细胞治疗的挑战的共同方法是开发适合于临床应用的多官能基因递送载体。缺乏安全,高效的基因传递系统是基因治疗的主要关注点。同时,细胞产物的基因工程移植前可以克服细胞治疗的严重挑战,如低效率( 例如,在心脏字段,只有约5%的功能改善,实现后干细胞移植1 )和差保留/植入在损伤部位( 即,细胞保留低于5 – 10%几分钟到几小时内口服ST-应用,无论给药途径2,3,4)。
迄今为止,病毒载体大大超过在效率,这导致了在临床试验中其广泛应用方面非病毒系统(〜67%)5。然而,病毒载体携带在携带的遗传物质6的尺寸严重的风险,如免疫原性(和随后的炎症反应,有严重的并发症),致癌性,和限制。由于这些安全问题和病毒载体的生产成本高,使用非病毒系统的是在某些情况下7,8优选的。它特别适合用于需要瞬时遗传校正病症,诸如的调控血管生成( 例如,用于CVD处理)的生长因子的表达或国内配送疫苗的RY。
本组的递送系统通过结合支链25-kDa的聚乙烯亚胺(PEI),并通过生物素-链霉亲和相互作用9结合在一起的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(MNP)而设计的。该载体是用于细胞基因工程,从而允许他们的移植之前同时磁化的潜在工具。后者提供了一种用于磁性引导/保持,这是特别有前途的今天,先进的磁性靶向技术正在研制成功10的基础。此外,所得到的磁响应的细胞必须是潜在的非侵入性通过磁共振成像(MRI)或磁性粒子成像11,12监测。
在PEI / MNP载体的情况下,聚胺保证了从低分子化因子核酸缩合,从而保护 s时,细胞载体内化和内体逃逸5。所述的MNP补充PEI的特性,不仅在磁性引导的方面,还通过降低已知的PEI毒性7,13,14。此前,PEI / MNP载体性质在输送效率( 即,质粒DNA和miRNA)和安全性方面,通过使用成纤维细胞和人类间质干细胞15,16调整。
在该手稿上PEI /的MNP的对于miRNA修饰细胞的生成应用程序的详细方案描述17。为了这个目的,将HUVEC被使用并且表示用于在体外血管生成一个建立的模型。他们是具有挑战性的转染,并很容易受到有毒影响18,19,屁股= “外部参照”> 20。另外,我们提供一种算法来评估这些细胞在体外 ,包括它们的定位,细胞间通讯,和MRI检测。
生产装载有超顺磁性纳米颗粒和其进一步磁控制的指导基因工程细胞的呈现在当前协议。这种策略的成功应用允许的细胞治疗的一些困难,例如在受伤区域2,3,4低保留和植入差分辨率,通过对移植提供靶向细胞产物。此外,同时引入适当选择的遗传物质的可促进细胞特性,从而可以增加功能性益处41。
<p…The authors have nothing to disclose.
我们要感谢G·富尔达(电子显微镜中心,罗斯托克大学,德国)用于收购过滤顺磁纳米颗粒的TEM图像,并履行其X射线分析技术支持。在RTC罗斯托克进行的工作是由联邦教育与研究部德国(FKZ 0312138A,FKZ 316159和VIP + 03VP00241)和国家梅克伦堡 – 前波莫瑞州与欧盟结构基金(ESF / IV-WM-B34-支持0030/10和ESF / IV-BM-B35-0010 / 12)和由DFG(DA 1296-1),则湿热基金会和德国心脏基金会(F / 01/12)。弗兰克·威克霍斯特由欧盟第七框架计划的研究项目 “Nanomag” FP7-NMP-2013-大7的支持。
PEI 25 kDa | Sigma Aldrich | 408727 | |
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | |
PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | Containing Sephadex G-25 Medium |
Ninhydrin Reagent solution 2% | Sigma Aldrich | 7285 | |
Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
Microplate reader Model 680 | Bio-Rad | ||
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega | Z5481 | |
Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45µm |
Libra 120 transmission electron microscope | Zeiss | Acceleration Voltage 120KV | |
Sapphire X-ray detector | EDAX-Amatek | ||
Cell culture plastic | TPP | ||
NHS-Esther Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-31 | |
NHS-Esther Atto 488 | ATTO-TEC GmbH | AD 488-31 | |
Cy5 miRNA Label IT kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
Biotin Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
Collagense Type IV Gibco | Thermo Scientific | 17104019 | |
Endothelial growth medium, EGM-2 | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
anti-PECAM-1 antibody | Santa Cruz | sc-1506 | |
MS MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Scientific | L10119 | |
Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control | Thermo Scientific | AM17120 | "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript |
Pre-miR miRNA Precursor Molecules – Negative Control | Thermo Scientific | AM17110 | "scr-miR" in the manuscript |
Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor | Thermo Scientific | AM10916 | |
LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | 4% solution in PBS |
DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 | |
NucleoSpin RNA isolation Kit | Machery-Nagel | 740955 | |
mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Scientific | AM1560 | |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4366596 | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4368814 | |
hsa-miR-92a TaqMan assay | Thermo Scientific | 000431 | Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU |
FastGene Taq Ready Mix | Nippon Genetics | LS27 | |
ITGA5 TaqMan assay | Thermo Scientific | Hs01547673_m1 | |
RNU6B TaqMan assay | Thermo Scientific | 001093 | |
18S rRNA Endogenous Control | Thermo Scientific | 4333760F | |
Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | |
CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
BSA | Sigma Aldrich | ||
MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
7.1 Tesla animal MRI system | Bruker Corporation | A7906 | |
ImageJ software | National Institutes of Health | upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH) | |
MPS device | Bruker Biospin | ||
Matlab software | Mathworks | ||
Ring Neodym Magnet | magnets4you GmbH | RM-10x04x05-G | ø 10 mm; remanescence is ~1.3T, coercivity ≥ 955 kA/m |
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Scientific | C10340 | |
FluorSave Reagent | Merck | 345789 | |
Ultrasonic bath | Bandelin electronic | Type: RK 100 SH |