Rewiring Neuronal Circuits: een nieuwe methode voor snelle neuritische verlenging en functionele neuronale verbinding
Summary
Deze procedure beschrijft hoe snel neurieten georganiseerd in microfluïdische kamers kunnen initiëren, verlengen en verbinden met behulp van poly-D-lysine beklede kralen die zijn bevestigd aan micropipetten die leiden tot neuriet verlenging.
Abstract
Brain en ruggenmerg letsel kan leiden tot blijvende invaliditeit en dood, omdat het nog steeds niet mogelijk is om neuronen te regenereren over lange afstanden en ze nauwkeurig opnieuw te verbinden met een geschikt doelwit. Hier wordt een procedure beschreven om snel te initiëren, verlengen en nauwkeurig nieuwe functionele neuronale circuits over lange afstanden aan te sluiten. De toegevoerde uitbreidingssnelheden bereiken meer dan 1,2 mm / u, 30-60 keer sneller dan de in vivo- snelheden van de snelst groeiende axonen van het perifere zenuwstelsel (0,02 tot 0,04 mm / u) 28 en 10 keer sneller dan eerder gemeld voor hetzelfde Neuronale type in een vroeger stadium van ontwikkeling 4 . Ten eerste worden geïsoleerde populaties van rathippocampale neuronen gedurende 2-3 weken in microfluïdische inrichtingen geteeld om de cellen nauwkeurig te positioneren, waardoor gemakkelijke micromanipulatie en experimentele reproduceerbaarheid mogelijk zijn. Vervolgens worden kralen bedekt met poly-D-lysine (PDL) op neurieten geplaatst om lijmconstructie te vormenDaden en pipette micromanipulatie wordt gebruikt om het resulterende kraal-neurietcomplex te verplaatsen. Naarmate de kraal wordt verplaatst, trekt het een nieuwe neuriet uit die over honderden micrometers kan worden verlengd en functioneel in een doelcel in minder dan 1 uur verbonden is. Dit proces maakt experimentele reproduceerbaarheid en gemak van manipulatie mogelijk, terwijl langzamere chemische strategieën worden omzeild om neurietgroei te stimuleren. Voorlopige metingen die hier worden gepresenteerd, tonen een neuronale groeitempo ver boven fysiologische Door deze innovaties te combineren staat de precieze vestiging van neuronale netwerken in cultuur met een ongekende mate van controle mogelijk. Het is een nieuwe methode die de deur opent voor een overvloed aan informatie en inzichten in signaaloverdracht en communicatie binnen het neuronale netwerk, alsook een speeltuin om de grenzen van neuronale groei te verkennen. De mogelijke toepassingen en experimenten zijn wijdverspreid met directe implicaties voor therapieën die gericht zijn op het opnieuw aansluiten van neuronaL circuits na trauma of in neurodegeneratieve ziekten.
Introduction
Schade aan het volwassen centrale zenuwstelsel (CNS) kan leiden tot blijvende handicap door meerdere mechanismen die axonale hergroei beperken 1 . Na aanleiding van het letsel vormen veel CNS-axons geen nieuwe groeikegel en worden er geen effectieve regeneratieve respons opgebouwd 2 . Bovendien, schade en littekenweefsel rondom CNS laesies belemmeren axonale groei 1 , 2 , 3 significant. Huidige therapieën ter bevordering van CNS-regeneratie na verwonding hebben gericht op het vergroten van het intrinsieke groeipotentieel van de gewonde neuron en op het maskeren van de remmers van de axonale verlenging geassocieerd met myeline puin en de glialarc 1 , 3 . Desondanks blijft de mogelijkheid om lange axonen te verteren naar verre doelen en om passende functionele synaptes te vormen, sterk beperkt 4 , </suP> 5 , 6 , 7 .
In het huidige werk worden microbeads, pipette micromanipulation en microfluidische apparaten gebruikt om snel nieuwe initiatieven te verlengen, verlengen en nauwkeurig nieuwe, functionele neuronale circuits over lange afstanden aan te sluiten. Vorige werk heeft aangetoond dat poly-D-lysine-beklede kralen (PDL-kralen) membraanhechting veroorzaken, gevolgd door de clustering van synaptische vesikelcomplexen en de vorming van functionele presynaptische boutons 8 . Het werd ook gebleken dat wanneer de PDL-kraal mechanisch weggetrokken wordt na de presynaptische differentiatie, de synaptische eiwitcluster volgt op de kraal, waarbij een nieuwe neuriet wordt geïnitieerd 9 . De volgende procedure exploiteert dit feit samen met het vermogen om embryonale hippocampale neuronen van ratten te culturen in georganiseerde gebieden op een deklaag met gebruikmaking van polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdische inrichtingen om een neuronalecircuit.
Deze PDMS microfluidische apparaten zijn niet-giftig, optisch transparant en bestaan uit twee kamers verbonden door een systeem van microkanalen. Eenmaal op een deklaag gemonteerd, dient elk apparaat als een vorm om neuronale groei te leiden en gezonde neuronale culturen op nauwkeurige patronen langer dan 4 weken in vitro te handhaven .
Hier wordt een kader voorgesteld om de grenzen van uitbreiding en functionaliteit van de nieuwe neuriet te onderzoeken. Nieuwe, functionele neurieten worden gecreëerd en gepositioneerd voor controllable (re) wire neuronale netwerken. De toegevoerde uitbreidingssnelheden zijn sneller dan 20 μm / min over afstanden van millimeters en functionele verbindingen worden vastgesteld. Deze resultaten tonen onverwacht dat de intrinsieke capaciteit van deze neurieten voor verlenging veel sneller is dan eerder gedacht. Deze voorgestelde mechanische aanpak omzeilt langzame chemische strategieën en zorgt voor een gecontroleerde verbinding met een specifiek doel. thIs techniek opent nieuwe mogelijkheden voor de in vitro studie van nieuwe therapieën om neuronale connectiviteit na herstel te herstellen. Het maakt ook het manipuleren en herbinnen van neuronale netwerken in staat om fundamentele aspecten van neuronale signaalverwerking en neuronale functie in vitro te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met behulp van standaard micromanipulatie en innovatieve microfluïdische apparaten werd een nieuwe techniek ontwikkeld om snel nieuwe initiatieven te verlengen, verlengen en precies aansluiten op nieuwe, functionele neuronale circuits over grote afstanden. Pipette micromanipulation is een algemeen instrument in de meeste neurowetenschappen labs 4 , 13 . De echte uitdaging om reproduceerbare en betrouwbare resultaten te behalen, was de standaardisatie van gezond…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Yoichi Miyahara bedanken voor veel nuttige discussies en inzichten. MA en PG erkennen financiering van NSERC.
Materials
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95mmx15mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15mL Polypropylene Conical Tube, 17x120mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200uL Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2-20uL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 um | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 ml Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, – Magnesium Chloride, – Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
Referencias
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
- Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
- Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
- General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database Available from: https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016)
- Strober, W. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
- Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925 (2010).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358 (2015).
- Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
- Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
- Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem. Biophys. 27 (3), 135-155 (1995).
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
- Waxman, S. G., Kocsis, J. D. . The axon: structure, function and pathophysiology. , (1995).
- Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
- Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).
