Rappel des circuits neuronaux: une nouvelle méthode pour une extension rapide des neurones et une connexion neuronale fonctionnelle
Summary
Cette procédure décrit comment lancer rapidement, étendre et connecter des neurites organisées dans des chambres microfluidiques en utilisant des billes revêtues de poly-D-lysine fixées sur des micropipettes qui guident l'allongement des neurites.
Abstract
Les lésions du cerveau et de la moelle épinière peuvent conduire à un handicap permanent et à la mort car il n'est toujours pas possible de régénérer les neurones sur de longues distances et de les reconnecter avec précision à une cible appropriée. Ici, une procédure est décrite pour lancer rapidement, allonger et connecter de manière précise de nouveaux circuits neuronaux fonctionnels sur de longues distances. Les taux d'extension atteints atteignent plus de 1,2 mm / h, 30 à 60 fois plus vite que les taux in vivo des axones à plus forte croissance du système nerveux périphérique (0,02 à 0,04 mm / h) 28 et 10 fois plus rapides que précédemment signalés pour le même Type neuronal à un stade de développement antérieur 4 . Premièrement, les populations isolées de neurones d'hippocampe de rat sont cultivées pendant 2-3 semaines dans des dispositifs microfluidiques pour positionner précisément les cellules, ce qui permet une micromanipulation facile et une reproductibilité expérimentale. Ensuite, les perles recouvertes de poly-D-lysine (PDL) sont placées sur des neurites pour former un conteneur adhésifLes actes et la micromanipulation par pipette sont utilisés pour déplacer le complexe résultant de neurites-perles. À mesure que le cordon est déplacé, il élimine un nouveau neurite qui peut être étendu sur des centaines de micromètres et connecté fonctionnellement à une cellule cible en moins de 1 h. Ce processus permet une reproductibilité expérimentale et une facilité de manipulation tout en contournant des stratégies chimiques plus lentes pour induire une croissance des neurites. Les mesures préliminaires présentées ici démontrent un taux de croissance neuronal dépassant largement les facteurs physiologiques. La combinaison de ces innovations permet l'établissement précis de réseaux neuronaux en culture avec un degré de contrôle sans précédent. C'est une méthode novatrice qui ouvre la porte à une multitude d'informations et d'informations sur la transmission et la communication du signal dans le réseau neuronal, tout en étant une aire de jeux pour explorer les limites de la croissance neuronale. Les applications et expériences potentielles sont répandues avec des implications directes pour les thérapies qui visent à reconnecter les neuronesL après un traumatisme ou dans des maladies neurodégénératives.
Introduction
Les blessures au système nerveux central adulte (SNC) peuvent entraîner un handicap permanent en raison de mécanismes multiples qui limitent la repousse axonale 1 . Après une blessure, de nombreux axones CNS ne forment pas un nouveau cône de croissance et ne parviennent pas à monter une réponse régénératrice efficace 2 . En outre, les dommages et les tissus cicatriciels entourant les lésions du SNC inhibent de manière significative la croissance axonale 1 , 2 , 3 . Les thérapies actuelles pour favoriser la régénération du SNC après une blessure se sont concentrées sur l'amélioration du potentiel de croissance intrinsèque du neurone blessé et sur le masquage des inhibiteurs de l'extension axonale associée aux débris de myéline et à la cicatrice gliale 1 , 3 . Malgré cela, la capacité de régénérer les axones longs vers des cibles distantes et de former des synapses fonctionnelles appropriées reste sévèrement limitée 4 , </suP> 5 , 6 , 7 .
Dans le présent travail, les microbilles, la micromanipulation par pipette et les dispositifs microfluidiques sont utilisés pour lancer rapidement, allonger et connecter avec précision de nouveaux circuits neuronaux fonctionnels sur de longues distances. Des travaux antérieurs ont montré que les perles revêtues de poly-D-lysine (PDL-beads) induisent une adhérence membranaire suivie par le regroupement des complexes de vésicules synaptiques et la formation de boutons presynaptiques fonctionnels 8 . Il a également été démontré que lorsque le cordon PDL s'écarte mécaniquement après la différenciation présynaptique, le groupe de protéines synaptiques suit le cordon, en initiant un nouveau neurite 9 . La procédure suivante exploite ce fait avec la capacité de culture des neurones embryonnaires de l'hippocampe de rats dans des régions organisées sur une lamelle en utilisant des dispositifs microfluidiques de polydiméthylsiloxane (PDMS) pour renvoyer précisément un neuronecircuit.
Ces dispositifs microfluidiques PDMS sont non toxiques, optiquement transparents et se composent de deux chambres connectées par un système de microcanaux. Une fois assemblé sur une lamelle, chaque dispositif sert de moule pour guider la croissance neuronale et maintenir des cultures neuronales saines sur des motifs précis pendant plus de 4 semaines in vitro .
Ici, un cadre est présenté pour étudier les limites d'extension et de fonctionnalité du nouveau neurite. Des neurites nouveaux et fonctionnels sont créés et positionnés de manière à pouvoir (re) câbler des réseaux neuronaux de manière contrôlable. Les taux d'extension atteints sont supérieurs à 20 μm / min par rapport aux distances à l'échelle millimétrique et les connexions fonctionnelles sont établies. Ces résultats montrent, de façon inattendue, que la capacité intrinsèque de ces neurites pour l'allongement est beaucoup plus rapide qu'on ne le pensait auparavant. Cette approche mécanique proposée contourne les stratégies chimiques lentes et permet une connexion contrôlée à une cible spécifique. ThLa technique ouvre de nouvelles avenues pour l'étude in vitro de nouvelles thérapies pour restaurer la connectivité neuronale après une blessure. Il permet également la manipulation et le câblage des réseaux neuronaux pour étudier les aspects fondamentaux du traitement du signal neuronal et de la fonction neuronale in vitro .
Protocol
Representative Results
Discussion
En utilisant une micromanipulation standard et des dispositifs microfluidiques innovants, une nouvelle technique a été développée pour initier, allonger et connecter de manière précise de nouveaux circuits neuronaux fonctionnels sur de grandes distances. La micromanipulation par pipette est un outil commun dans la plupart des laboratoires de neurosciences 4 , 13 . Le véritable défi pour obtenir des résultats reproductibles et fiables était la normalisa…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Yoichi Miyahara pour de nombreuses discussions et idées utiles. MA et PG reconnaissent le financement du CRSNG.
Materials
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95mmx15mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15mL Polypropylene Conical Tube, 17x120mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200uL Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2-20uL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 um | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 ml Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, – Magnesium Chloride, – Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
Referencias
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