Summary

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique come un<em> In vitro</em> Strumento di screening nella ricerca acustica

Published: June 08, 2017
doi:

Summary

L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare la preparazione, la cultura, il trattamento e l'immunostaining di esplosivi cochleari murine neonatali. La tecnica può essere utilizzata come uno strumento di screening in vitro nella ricerca uditiva.

Abstract

Mentre negli ultimi decenni sono stati notevoli progressi nella ricerca uditiva, non esiste ancora cura per la perdita di udito sensoriale (SNHL), una condizione che tipicamente comporta danni o perdite delle delicate strutture meccanosensoriali dell'orecchio interno. Nel corso degli ultimi anni sono emersi sofisticati esami in vitro e ex vivo, che hanno permesso lo screening di un numero crescente di composti potenzialmente terapeutici, minimizzando le risorse e accelerando gli sforzi per sviluppare cure per SNHL. Sebbene colture omogenee di alcuni tipi di cellule continuino a svolgere un ruolo importante nella ricerca attuale, molti scienziati ora si affidano a culture organotipiche più complesse di orecchie interne murine, noti anche come esplorazioni cochleari. La conservazione delle strutture cellulari organizzate all'interno dell'orecchio interno facilita la valutazione in situ di vari componenti dell'infrastruttura coclea, comprese le cellule dei capelli interni ed esterni, i neuroni dei gangli spirali, i neurE supportare le cellule. Qui presentiamo la preparazione, la cultura, il trattamento e l'immunostaining di esplosioni cochleari murine neonatali. L'attenta preparazione di questi esplosivi facilita l'individuazione di meccanismi che contribuiscono alla SNHL e costituisce uno strumento prezioso per la comunità di ricerca uditiva.

Introduction

Perdita uditiva sensoriale (SNHL) riflette danni all'orecchio interno o al percorso uditivo ascendente. Mentre la perdita dell'udito è il disordine sensoriale più comune nell'uomo 1 , non esistono ancora terapie curative 2 . Sebbene gli impianti cerebrali cocleari o uditivi possono ristabilire un certo grado di udito ai pazienti con SNHL grave o profonda, l'udienza fornita da questi dispositivi è ancora molto diversa da quella uditiva "naturale", specialmente durante i tentativi di comprendere il rumore del suono o di ascoltare la musica.

Mentre la degenerazione delle cellule di capelli è da tempo considerata la principale conseguenza degli eventi uditivi traumatici ( es. Esposizione a rumori elevati), vi è una crescente evidenza che le sinapsi che trasmettono informazioni dalle cellule dei capelli al nervo uditivo sono almeno altrettanto vulnerabili al trauma acustico 3 , 4 , 5 </sup > , 6 . Poiché le soglie audiometriche umane, l'attuale standard oro per la valutazione della funzione uditiva, non prevedono danni cellulari specifici nell'orecchio interno, sono necessari strumenti più raffinati per rilevare la degenerazione cellulare quanto prima e per avviare un trattamento adeguato 7 .

I trattamenti farmaceutici promettenti per la perdita dell'udito sono spesso testati in culture cellulari omogenee in vitro , ma tali sistemi non modellano in modo preciso il microambiente cocleare. Le cellule cochleari sono noti per secernere fattori trofici che influenzano altri tipi di cellule all'interno della coclea 8 , 9 , un processo cruciale in vivo che si perde quando l'organo di Corti 10 , 11 o Neuroni Ganglionici Spirali (SGNs) 12 viene coltivato in isolamento o quando Vengono analizzati i marcatori molecolariTuttavia, studi in vivo che possono essere necessari per la convalida dei dati in vitro per stabilire nuovi trattamenti personalizzati per la perdita dell'udito nel perseguimento della "medicina di precisione" richiedono risorse e tempi significativi. Quanto sforzo è necessario per perfezionare e realizzare iniezioni a membrana di orecchio medio o rotondo con test uditivi e la successiva dissezione di cochleari integrali. L'efficace screening dei composti promettenti nelle colture ex vivo organotipiche noti come esplosioni cochleari fornisce un'alternativa economica e affidabile 14 , 15 , 16 , 17 .

Questo articolo descrive un protocollo per generare, mantenere e valutare gli esplosivi cocleari trattati. Le applicazioni specifiche per questo modello vengono enfatizzate, tra cui l'utilizzo nell'ambito dello screeningDi composti potenzialmente terapeutici e la valutazione comparativa dei vettori virali per la terapia genica. Un approccio esplosivo ex vivo consente ai ricercatori di visualizzare gli effetti di un dato trattamento su diverse popolazioni cellulari in situ , facilitando l'identificazione dei meccanismi specifici di tipo cellulare e la successiva affinamento di terapie mirate.

Nel complesso, questa tecnica fornisce un modello per studiare la coclea ex vivo , preservando la conversazione vitale tra i diversi tipi di cellule che coesistono all'interno della coclea.

Protocol

Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Istituzionale di Assistenza e Assistenza Civile (IACUC) di Massachusetts Eye and Ear. Gli esperimenti sono stati condotti secondo il Codice Etico dell'Associazione Medica Mondiale. 1. Preparazione della dissezione Preparazione del tavolo chirurgico Usa il 70% di etanolo per disinfettare il tavolo chirurgico. Posizionare due pasticci nonsterili accanto al microscopio. Preparare…

Representative Results

Mentre molti protocolli si concentrano sull'organo di Corti explants, questa tecnica tenta di preservare l'anatomia dell'intero turno cochleare, inclusi gli SGN. Questo dà ai ricercatori l'opportunità di analizzare gli effetti di un dato trattamento sulle neuriti e sulla somata di SGN oltre all'organo di Corti. Effettuare una dissezione che conserva parte del modiolus, come descritto qui, è più tecnicamente impegnativo che esplodere l'organo di Corti da solo. …

Discussion

I ricercatori devono perfezionare la tecnica di dissezione prima di effettuare esperimenti che implicano esplosioni cochleari. Le cellule dei capelli sono comunemente danneggiate durante le dissezione eseguite presto nella curva di apprendimento e un momento particolarmente problematico per la loro integrità è la rimozione della membrana tectoria, che richiede mani costanti, strumenti e esperienze adeguate. Per risparmiare tempo e risorse, è necessario eseguire un controllo visivo sotto il microscopio di dissezione e…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto Nazionale di Sordità e altri Disturbi della Comunicazione con sovvenzioni R01DC015824 (KMS) e T32DC00038 (supporto SD), il Dipartimento della Difesa concede la W81XWH-15-1-0472 (KMS), la Fondazione Bertarelli (KMS) La Fondazione di Nancy Sayles Day (KMS) e il Centro di ricerca di tinnito di Lauer (KMS). Ringraziamo Jessica E. Sagers, BA per commenti insightful sul manoscritto.

Materials

Ampicillin, Sodium Salt Invitrogen 11593-027
anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) BD Transduction Laboratories 612044
anti-Myo7A antibody, rabbit Proteus Biosciences 25-6790
anti-NF-H antibody, chicken EMD Millipore AB5539
anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) Antibodies Inc. 75-028
anti-TuJ1 antibody, mouse BioLegend 801202
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg Corning 354241
CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 188161
CELLSTAR Cell Culture Dish, 100×20 mm Greiner Bio-One 664160
CELLSTAR Cell Culture Dish, 35×10 mm, four inner rings Greiner Bio-One 627170
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60×15 mm Greiner Bio-One 628160
CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 227261
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50×7 mm Ted Pella Inc. 14027-20
Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13-0.16mm Ted Pella Inc. 260368
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306
Distilled water, 500 ml Thermo Fisher Scientific 15230-162 
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml Thermo Fisher Scientific 10313-039
Dumont #4 Forceps Fine Science Tools 11241-30
Dumont #55 Forceps (Dumostar) Fine Science Tools 11295-51
Ethyl alcohol, Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% Sigma-Aldrich 459836-1L
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml Thermo Fisher Scientific 10437-028  Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer
Glutamate – GlutaMAX supplement, 100 ml Thermo Fisher Scientific 35050-061
goat anti-chicken-647 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21469
goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-11004
goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21124
goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21131
goat anti-rabbit-488 secondary antibody Thermo Fisher Scientific R37116
H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500ml EMD Millipore TMS-006-B
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red, 500 ml Thermo Fisher Scientific 14025-092
Instrument Tray with Lid Stainless Steel Mountainside Medical TechMed4255
Micro (dissecting) knife – angled 30° Fine Science Tools 10056-12
Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 VWR 16004-382
N-2 Supplement (100X), 5 ml Thermo Fisher Scientific 17502-048
NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 ml Thermo Fisher Scientific 25080-094
NaOH, sodium hydroxide solution, 1 l Thermo Fisher Scientific SS266-1
Normal Horse Serum (NHS) Invitrogen 16050130
Operating scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6806
Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline Sigma-Aldrich P6148 Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 ml Thermo Fisher Scientific 10010-023  Autoclave prior to use
Phalloidin, Alexa Fluor 568  Thermo Fisher Scientific A12380
Prep Pad, Non Sterile  Medline 05136CS
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml Eppendorf 022363719 Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml Eppendorf 022363204 Autoclave prior to use
Scalpel Blades – #15 Fine Science Tools 10015-00
Scalpel Handle – #4 Fine Science Tools 10004-13
Stemi 2000-C Stereo Microscope Zeiss  000000-1106-133
TCS SP5 confocal microscope Leica N/A
Triton-X (non-ionic surfactant) Integra T756.30.30
VectaShield antifade mounting medium for fluorescence Vector Laboratories, Inc. H-1000
Zipper Bag, Reclosable, 4'' x 6'' – 2 mil. thick Zipline 0609132541599

Referencias

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Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. J. Vis. Exp. (124), e55704, doi:10.3791/55704 (2017).

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