El objetivo de este protocolo es demostrar la preparación, cultivo, tratamiento e inmunotinción de los explantes cocleares murinos neonatales. La técnica puede utilizarse como una herramienta de cribado in vitro en la investigación auditiva.
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Artículo de método
Técnica de Explante Coclear Murino Neonatal como
En este artículo
Resumen
Resumen
Aunque ha habido notables avances en la investigación auditiva durante las últimas décadas, todavía no hay cura para la Pérdida de la Audición Sensorineural (SNHL), una condición que típicamente implica daño o pérdida de las delicadas estructuras mecanosensoriales del oído interno. Los ensayos sofisticados in vitro y ex vivo han surgido en los últimos años, permitiendo la selección de un número creciente de compuestos potencialmente terapéuticos, al tiempo que se minimizan los recursos y se aceleran los esfuerzos para desarrollar curas para SNHL. Aunque los cultivos homogéneos de ciertos tipos de células siguen desempeñando un papel importante en la investigación actual, muchos científicos ahora se basan en cultivos organotípicos más complejos de orejas internas murinas, también conocidas como explantes cocleares. La preservación de estructuras celulares organizadas dentro del oído interno facilita la evaluación in situ de diversos componentes de la infraestructura coclear, incluyendo las células ciliadas internas y externas, neuronas ganglionares espirales, neuronasItes y células de soporte. Aquí presentamos la preparación, cultivo, tratamiento e inmunotinción de los explantes cocleares murinos neonatales. La cuidadosa preparación de estos explantes facilita la identificación de mecanismos que contribuyen al SNHL y constituye una herramienta valiosa para la comunidad de investigadores de audición.
Introducción
La Pérdida Auditiva Sensorineural (SNHL) refleja daños en el oído interno o en la vía auditiva ascendente. Mientras que la pérdida auditiva es el déficit sensorial más común en los seres humanos 1 , las terapias curativas aún no existen 2 . Aunque los implantes cocleares o auditivos del tronco encefálico pueden restaurar un cierto grado de audición a los pacientes con SNHL severa a profunda, la audición proporcionada por estos dispositivos sigue siendo muy diferente de la audición "natural", especialmente durante los intentos de entender el habla o escuchar música.
Si bien la degeneración de....
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Protocolo
El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Massachusetts Eye and Ear. Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial.
1. Preparación de la disección
- Preparación de la mesa quirúrgica
- Use etanol al 70% para desinfectar la mesa quirúrgica.
- Coloque dos almohadillas de preparación no estériles junto al microscopio.
- Prepare la bandeja del instrumento, incluyendo tijeras de operación esterilizadas por calor, una manija de bisturí, un cuchillo micro, y fórceps (dos de cada ....
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Resultados
Mientras muchos protocolos se centran en el órgano de los explantes de Corti, esta técnica intenta preservar la anatomía de todo el giro coclear, incluyendo los SGN. Esto da a los investigadores la oportunidad de analizar los efectos de un determinado tratamiento en neurites y somata de SGNs además del órgano de Corti. Realizar una disección que conserva parte del modiolo, como se describe aquí, es técnicamente más difícil que explantar el órgano de Corti solo. Sin embargo, la neurita y .......
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Discusión
Los investigadores deben perfeccionar la técnica de disección antes de llevar a cabo experimentos relacionados con explantes cocleares. Las células ciliadas son comúnmente dañadas durante las disecciones realizadas en las primeras etapas de la curva de aprendizaje, y un momento particularmente problemático para su integridad es la eliminación de la membrana tectorial, que requiere manos estables, herramientas adecuadas y experiencia. Para ahorrar tiempo y recursos, se debe realizar un control visual bajo el microscopio .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Sordera y otros trastornos de la comunicación subvenciones R01DC015824 (KMS) y T32DC00038 (apoyo SD), el Departamento de Defensa W81XWH-15-1-0472 (KMS), la Fundación Bertarelli (KMS), el Nancy Sayles Day Foundation (KMS) y el Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Damos las gracias a Jessica E. Sagers, BA por comentarios perspicaces sobre el manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ampicilina, sal de sodio | Invitrogen | 11593-027 | |
| anticuerpo anti-CtBP2, ratón (IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anticuerpo anti-Myo7A, conejo | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anticuerpo anti-NF-H, pollo | EMD Millipore | AB5539 | |
| anticuerpo anti-PSD95, ratón(IgG2a) | Anticuerpos Inc. | 75-028 | |
| Anticuerpo anti-TuJ1 de ratón, | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak de ratón Adhesivo para células y tejidos, 5 mg | Tubos de | 354241 | |
| CELLSTAR de 15 mL, fondo cónico, graduación, estéril | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR Placa de cultivo celular, 100 x 20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Plato de cultivo celular, 35 x 10 mm, 4 anillos interiores | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR Plato de cultivo celular, 60 x 15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 mL Tubos de centrífuga, fondo cónico, graduación, estéril | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Esmalte de uñas transparente | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 72180 | |
| Platos con fondo de vidrio de pared transparente (vidrio de 40 mm), PELCO®, Funda/20, 50 x 7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Cubreobjetos, Redondos, Vidrio, 10 mm de diámetro, Espesor #1, 0.13 - 0.16mm | Ted Pella Inc. | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Agua destilada, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), alto contenido de glucosa, piruvato, sin glutamina, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Pinzas Dumont #4 | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Pinzas (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Alcohol etílico (EtOH), puro, 200 grados, anhidro, ≥ 99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L Suero | |
| fetal bovino (FBS), calificado, regiones aprobadas por el USDA, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Alícuota en tubos de 50 mL y almacenar en -20° C congelador |
| anti-pollo de cabra-647 anticuerpo secundario | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| anti-ratón de cabra (IgG)-568 anticuerpo secundario | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| anti-ratón de cabra (IgG1)-568 anticuerpo secundario | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| anti-ratón de cabra (IgG2a)-488 anticuerpo secundario | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| anticuerpo secundario anti-conejo-488 para cabras | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, estéril, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| Solución salina equilibrada de Hank's (HBSS), calcio, magnesio, rojo sin fenol, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Bandeja de instrumentos con tapa Acero inoxidable | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| Micro (disección) cuchillo – angulado 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Portaobjetos de microscopio, VistaVision, codificados por colores, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm de grosor, blanco, paquete de 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Suplemento (100X), 5 mL | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, solución de bicarbonato de sodio al 7,5 %, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, solución de hidróxido de sodio, 1 L | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Suero normal para caballos (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Tijeras de operación | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehído (PFA), grado reactivo, cristalino | Sigma-Aldrich | P6148 | Antes de usar: Establezca procedimientos operativos estándar basados en protocolos disponibles en línea |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave antes de su uso |
| Faloidina, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| , no estéril | Medline | 05136CS | |
| Tubos de Microcentrífuga Safe-Lock, Polipropileno, 0,5 mL | Autoclave Eppendorf | 022363719 | antes de usar |
| Tubos de microcentrífuga Safe-Lock, Polipropileno, 1,5 mL | Autoclave Eppendorf | 022363204 | antes de usar |
| Hojas de bisturí - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Mango de bisturí - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Microscopio estereoscópico | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Microscopio confocal TCS SP5 | Leica | N/A | |
| Triton-X (tensioactivo no iónico) | Integra | T756.30.30 | |
| Medio de montaje antidecoloración VectaShield para fluorescencia | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Bolsa con Cremallera, Resellable, 4 x 6'' - 2 mm de grosor | Zipline 0609132541599 |
Referencias
- Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
- Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062(2014).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C.
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Reimpresiones y permisos
