نقدم طريقة الرواية التي تستخدم البوليمرات كتلة استجابة الصورة للتحكم الزماني الزماني أكثر كفاءة من إسكات الجينات مع عدم الكشف عن الآثار خارج الهدف. بالإضافة إلى ذلك، يمكن التنبؤ بالتغيرات في التعبير الجيني باستخدام مقايسات إطلاق سيرنا مباشرة ونمذجة حركية بسيطة.
وهناك حاجة إلى مواد وطرق جديدة لتحسين السيطرة على ملزمة مقابل الافراج عن الأحماض النووية لمجموعة واسعة من التطبيقات التي تتطلب التنظيم الدقيق للنشاط الجيني. على وجه الخصوص، والمواد المحفزة استجابة جديدة مع تحسين السيطرة المكانية الزمانية على التعبير الجيني فتح منصات قابلة للترجمة في اكتشاف المخدرات وتكنولوجيات الطب التجديدي. وعلاوة على ذلك، فإن تعزيز القدرة على السيطرة على إطلاق الحمض النووي من المواد من شأنه أن يتيح تطوير أساليب مبسطة للتنبؤ فعالية نانوكارير مسبق ، مما يؤدي إلى الفحص المعجل من مركبات التسليم. هنا، نقدم بروتوكول للتنبؤ الكفاءة إسكات الجينات وتحقيق السيطرة المكانية الزمانية على التعبير الجيني من خلال نظام نانوكارير نظام استجابة وحدات. إن رنا التداخل الصغير (سيرنا) معقد مع مبيغ- b- بول (5- (3- (أمينو) بروبوكسي) -2-نيتروبنزيل ميثاكريلات) (مبيغ- ب -P (أبنبا)آرإم مستقرة نانوكاريرز التي يمكن السيطرة عليها مع الضوء لتسهيل الانضباطي، على / قبالة الإفراج سيرنا. نحن الخطوط العريضة اثنين من المقايسات التكميلية استخدام مضان ارتباط الطيفي والهلام الكهربائي لقياس الكمي الدقيق لإطلاق سراح سيرنا من حلول محاكاة البيئات داخل الخلايا. وقد تم دمج المعلومات المكتسبة من هذه المقايسات في نموذج الحركية رنا التدخل (رني) بسيط للتنبؤ ردود الفعل إسكات ديناميكية لمختلف الظروف التحفيز الصورة. في المقابل، سمحت هذه الظروف التشعيع الأمثل صقل بروتوكول جديد لمراقبة سباتوتيوتومبوري إسكات الجينات. هذه الطريقة يمكن أن تولد أنماط الخلوية في التعبير الجيني مع خلية إلى خلية القرار وليس الكشف عن آثار خارج الهدف. مجتمعة، نهجنا يوفر وسيلة سهلة الاستخدام للتنبؤ التغيرات الديناميكية في التعبير الجيني والسيطرة على وجه التحديد سيرنا النشاط في المكان والزمان. هذه المجموعة من المقايسات يمكن تكييفها بسهولة لاختبار مجموعة واسعة من أوتنظمها المحفزة استجابة من أجل التصدي للتحديات الرئيسية ذات الصلة إلى العديد من التطبيقات في مجال البحوث الطبية الحيوية والطب.
رنا التدخل الصغيرة (سيرناس) توسط إسكات الجينات بعد النسخي من خلال مسار رني الحفاز التي هي محددة للغاية، وقوية، وقابلة للتخصيص تقريبا أي الجينات المستهدفة 1 . وقد مكنت هذه الخصائص واعدة العلاجات سيرنا للمضي قدما في التجارب السريرية الإنسان لعلاج العديد من الأمراض، بما في ذلك سرطان الجلد النقيلي والهيموفيليا 2 ، 3 . ومع ذلك، لا تزال هناك قضايا تسليم هامة عرقلت الترجمة 4 . على وجه الخصوص، يجب أن تظل مركبات التسليم مستقرة وحماية سيرناس من تدهور خارج الخلية، ولكن أيضا إطلاق حمولة في السيتوبلازم 5 . وعلاوة على ذلك، تتطلب العديد من التطبيقات رني أساليب محسنة لتنظيم إسكات الجينات في الفضاء والزمان 6 ، مما سيقلل من الآثار الجانبية في العلاجات سيرنا 7 وتمكين التحويليةدفانسس في تطبيقات تتراوح بين ميكروأرس الخلية لاكتشاف المخدرات 8 إلى تعديل ردود الخلايا في السقالات التجدد 9 . هذه التحديات تسلط الضوء على الحاجة إلى مواد وأساليب جديدة لتحسين السيطرة ملزمة مقابل الافراج عنهم في نانوكاريرز سيرنا.
واحدة من الاستراتيجيات الواعدة للسيطرة على إطلاق سراح سيرنا وتعزيز التنظيم المكاني الزماني هو استخدام المواد المحفزة استجابة 10 . على سبيل المثال، تم تصميم مجموعة واسعة من المواد الحيوية مع تقارب ارتباط الحمض النووي للتغيير استجابة لتغير الأكسدة المحتملة أو درجة الحموضة، أو المجالات المغناطيسية المطبقة، الموجات فوق الصوتية، أو الضوء 11 . على الرغم من أن العديد من هذه النظم تظهر تحسين السيطرة على نشاط الحمض النووي، واستخدام الضوء كمحفز هو مفيد بشكل خاص نظرا لاستجابتها الزمنية لحظية، الدقة المكانية دقيقة، وسهولة الانضباط <sup كلاس = "كريف"> 12. وعلاوة على ذلك، وقد أثبتت إمكانات التكنولوجيات الحساسة للصور لتنظيم التعبير الجيني من قبل الدولة المرتقب محفز نظم وأنظمة أوبتوجينيتيك للدولة من بين الفن؛ ومع ذلك، فإن هذه النظم تعاني من العديد من التحديات بما في ذلك قدرات محدودة لتنظيم الجينات الذاتية، وشواغل السلامة مثل المناعة، والصعوبات في تقديم الجمعيات متعددة المكونات 13 ، 14 ، 15 . صورة مناسبة استجابة نانوكاريرز سيرنا هي مناسبة بشكل مثالي للتغلب على هذه السلبيات وتوفير نهج أبسط وأكثر قوة لتعديل سباتيوتيمبورالي التعبير الجيني 16 ، 17 ، 18 . لسوء الحظ، وأساليب التنبؤ بدقة استجابة البروتين ضربة قاضية الناتجة لا تزال بعيد المنال.
التحدي الرئيسي هو أن التقييمات الكمية لإطلاق سيرنا هينادر 19 ، 20 ، وحتى عندما يتم تنفيذ هذه التقييمات، فإنها لم يقترن لتحليلات سيرنا / البروتينات دوران دوران. كل من كمية سيرنا صدر ومثابرة / عمرها هي المحددات الهامة للديناميات إسكات الجينات الناتجة. وبالتالي، فإن الافتقار إلى هذه المعلومات هو فصل رئيسي يمنع التنبؤ الدقيق للجرعة الاستجابة في رني 21 . ومن شأن التصدي لهذا التحدي أن يعجل بصياغة العلاقات المناسبة بين الهيكل والوظيفة في الحواجز النانوية، وأن يقدم معلومات أفضل عن تصاميم المواد البيولوجية 22 . وعلاوة على ذلك، فإن مثل هذه النهج تمكين تطوير بروتوكولات الجرعات سيرنا أكثر فعالية. في محاولة لفهم الاستجابة إسكات ديناميكية، وقد حققت عدة مجموعات النماذج الرياضية من رني 23 ، 24 ، 25 . وكانت هذه الأطرناجحة في توفير رؤى في التغييرات بوساطة سيرنا في التعبير الجيني وتحديد خطوات الحد من معدل 26 . ومع ذلك، تم تطبيق هذه النماذج فقط على نظم تسليم الجينات التجارية (على سبيل المثال ، ليبوفيكتامين وبولي إيثيلينيمين (بي)) التي ليست قادرة على تسيطر الإفراج سيرنا، وتعقيد النماذج قد حدت بشدة من فائدة 27 . هذه العيوب تسلط الضوء على الحاجة غير الملباة للمواد الجديدة قادرة على الافراج عن سيرنا قابل للتعديل بدقة جنبا إلى جنب مع النماذج الحركية التنبؤية مبسطة وسهلة الاستخدام.
أسلوبنا يعالج كل هذه التحديات من خلال دمج منصة حساسة للضوء نانوكارير مع أساليب مقترنة لتحديد سيرنا الحرة وديناميات نموذج رني. على وجه الخصوص، يتم التحكم في منصة لدينا سيرينا بالتحكم بدقة الإفراج 28 من قبل اثنين من الطرق التكميلية لقياس بدقة مغلفة مقابل الامم المتحدةملزمة سيرنا. يتم إدخال البيانات التجريبية من هذه المقايسات في نموذج حركي بسيط للتنبؤ الكفاءة إسكات الجينات مسبقا 29 . وأخيرا، فإن طبيعة تشغيل / إيقاف نانوكاريرز بسهولة استغلالها لتوليد أنماط الخلايا في التعبير الجيني مع التحكم المكاني على نطاق طول الخلوية. وهكذا، فإن هذه الطريقة توفر طريقة قابلة للتكيف بسهولة للسيطرة والتنبؤ إسكات الجينات في مجموعة متنوعة من التطبيقات التي من شأنها أن تستفيد من التنظيم المكاني الزماني للسلوك الخلية.
هناك خطوات قليلة في الطريقة التي تعتبر حاسمة بشكل خاص. عند صياغة نانوكاريرز، ترتيب إضافة عنصر وسرعة الخلط هما معلمات هامة تؤثر على فعالية 39 . يتطلب هذا البروتوكول أن المكون الموجبة، MPEG- ب -P (أبنبا)، يضاف إلى عنصر أنيوني، سيرنا، بطريقة قطرة بينما فورت?…
The authors have nothing to disclose.
يشكر المؤلفون المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة في المعاهد الوطنية للصحة (نيه) على الدعم المالي من خلال جائزة التنمية المؤسسية (إيديا) بموجب المنحة رقم P20GM103541 وكذلك رقم المنحة P20GM10344615. ولا تعكس البيانات الواردة في هذه الوثيقة آراء المعاهد الوطنية للصحة. ونعترف أيضا بمعهد ديلاوير للتكنولوجيا الحيوية (ديبي) ومكتب التنمية الاقتصادية في ديلاوير (ديدو) للحصول على الدعم المالي من خلال جائزة مركز العلوم البيولوجية للتكنولوجيا المتقدمة (بيوسينس كات) (12A00448).
siRNA | Sigma-Aldrich | SIC001 | non-targeted, universal negative control |
mPEG-b-P(APNBMA) | synthesized in our lab | N/A | photo-responsive polymer |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 436143 | |
rubber gasket | McMaster-Carr | 3788T21 | 0.5 mL thick |
UV laser | Excelitas Technologies | Omnicure S2000 | collimating lens and 365 nm filter used |
agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
ethidium bromide | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
siRNA labelled with Dy547 | GE Healthcare Dharmacon, Inc. | custom order | fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand |
microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | pre-cleaned glass |
Secure-Seal Spacer | Life Technologies | S24735 | double-sided adhesive |
LSM 780 | Carl Zeiss | N/A | confocal microscope |
ZEN 2010 | Carl Zeiss | N/A | FCS analysis software |
MATLAB | MathWorks | N/A | programming language |
NIH/3T3 cells | ATCC | ATCC CRL-1658 | |
DMEM | Mediatech | 10-013-CV | growth media |
fetal bovine serum | Mediatech | 35-011-CV | heat-inactivated |
penicillin-streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
Opti-MEM | Life Technologies | 11058021 | transfection media |