التنبؤ الجينات إسكات من خلال التحكم المكاني الزماني من سيرنا الافراج عن نانوكاريرز البوليمرية استجابة الصورة
Summary
نقدم طريقة الرواية التي تستخدم البوليمرات كتلة استجابة الصورة للتحكم الزماني الزماني أكثر كفاءة من إسكات الجينات مع عدم الكشف عن الآثار خارج الهدف. بالإضافة إلى ذلك، يمكن التنبؤ بالتغيرات في التعبير الجيني باستخدام مقايسات إطلاق سيرنا مباشرة ونمذجة حركية بسيطة.
Abstract
وهناك حاجة إلى مواد وطرق جديدة لتحسين السيطرة على ملزمة مقابل الافراج عن الأحماض النووية لمجموعة واسعة من التطبيقات التي تتطلب التنظيم الدقيق للنشاط الجيني. على وجه الخصوص، والمواد المحفزة استجابة جديدة مع تحسين السيطرة المكانية الزمانية على التعبير الجيني فتح منصات قابلة للترجمة في اكتشاف المخدرات وتكنولوجيات الطب التجديدي. وعلاوة على ذلك، فإن تعزيز القدرة على السيطرة على إطلاق الحمض النووي من المواد من شأنه أن يتيح تطوير أساليب مبسطة للتنبؤ فعالية نانوكارير مسبق ، مما يؤدي إلى الفحص المعجل من مركبات التسليم. هنا، نقدم بروتوكول للتنبؤ الكفاءة إسكات الجينات وتحقيق السيطرة المكانية الزمانية على التعبير الجيني من خلال نظام نانوكارير نظام استجابة وحدات. إن رنا التداخل الصغير (سيرنا) معقد مع مبيغ- b- بول (5- (3- (أمينو) بروبوكسي) -2-نيتروبنزيل ميثاكريلات) (مبيغ- ب -P (أبنبا)آرإم مستقرة نانوكاريرز التي يمكن السيطرة عليها مع الضوء لتسهيل الانضباطي، على / قبالة الإفراج سيرنا. نحن الخطوط العريضة اثنين من المقايسات التكميلية استخدام مضان ارتباط الطيفي والهلام الكهربائي لقياس الكمي الدقيق لإطلاق سراح سيرنا من حلول محاكاة البيئات داخل الخلايا. وقد تم دمج المعلومات المكتسبة من هذه المقايسات في نموذج الحركية رنا التدخل (رني) بسيط للتنبؤ ردود الفعل إسكات ديناميكية لمختلف الظروف التحفيز الصورة. في المقابل، سمحت هذه الظروف التشعيع الأمثل صقل بروتوكول جديد لمراقبة سباتوتيوتومبوري إسكات الجينات. هذه الطريقة يمكن أن تولد أنماط الخلوية في التعبير الجيني مع خلية إلى خلية القرار وليس الكشف عن آثار خارج الهدف. مجتمعة، نهجنا يوفر وسيلة سهلة الاستخدام للتنبؤ التغيرات الديناميكية في التعبير الجيني والسيطرة على وجه التحديد سيرنا النشاط في المكان والزمان. هذه المجموعة من المقايسات يمكن تكييفها بسهولة لاختبار مجموعة واسعة من أوتنظمها المحفزة استجابة من أجل التصدي للتحديات الرئيسية ذات الصلة إلى العديد من التطبيقات في مجال البحوث الطبية الحيوية والطب.
Introduction
رنا التدخل الصغيرة (سيرناس) توسط إسكات الجينات بعد النسخي من خلال مسار رني الحفاز التي هي محددة للغاية، وقوية، وقابلة للتخصيص تقريبا أي الجينات المستهدفة 1 . وقد مكنت هذه الخصائص واعدة العلاجات سيرنا للمضي قدما في التجارب السريرية الإنسان لعلاج العديد من الأمراض، بما في ذلك سرطان الجلد النقيلي والهيموفيليا 2 ، 3 . ومع ذلك، لا تزال هناك قضايا تسليم هامة عرقلت الترجمة 4 . على وجه الخصوص، يجب أن تظل مركبات التسليم مستقرة وحماية سيرناس من تدهور خارج الخلية، ولكن أيضا إطلاق حمولة في السيتوبلازم 5 . وعلاوة على ذلك، تتطلب العديد من التطبيقات رني أساليب محسنة لتنظيم إسكات الجينات في الفضاء والزمان 6 ، مما سيقلل من الآثار الجانبية في العلاجات سيرنا 7 وتمكين التحويليةدفانسس في تطبيقات تتراوح بين ميكروأرس الخلية لاكتشاف المخدرات 8 إلى تعديل ردود الخلايا في السقالات التجدد 9 . هذه التحديات تسلط الضوء على الحاجة إلى مواد وأساليب جديدة لتحسين السيطرة ملزمة مقابل الافراج عنهم في نانوكاريرز سيرنا.
واحدة من الاستراتيجيات الواعدة للسيطرة على إطلاق سراح سيرنا وتعزيز التنظيم المكاني الزماني هو استخدام المواد المحفزة استجابة 10 . على سبيل المثال، تم تصميم مجموعة واسعة من المواد الحيوية مع تقارب ارتباط الحمض النووي للتغيير استجابة لتغير الأكسدة المحتملة أو درجة الحموضة، أو المجالات المغناطيسية المطبقة، الموجات فوق الصوتية، أو الضوء 11 . على الرغم من أن العديد من هذه النظم تظهر تحسين السيطرة على نشاط الحمض النووي، واستخدام الضوء كمحفز هو مفيد بشكل خاص نظرا لاستجابتها الزمنية لحظية، الدقة المكانية دقيقة، وسهولة الانضباط <sup كلاس = "كريف"> 12. وعلاوة على ذلك، وقد أثبتت إمكانات التكنولوجيات الحساسة للصور لتنظيم التعبير الجيني من قبل الدولة المرتقب محفز نظم وأنظمة أوبتوجينيتيك للدولة من بين الفن؛ ومع ذلك، فإن هذه النظم تعاني من العديد من التحديات بما في ذلك قدرات محدودة لتنظيم الجينات الذاتية، وشواغل السلامة مثل المناعة، والصعوبات في تقديم الجمعيات متعددة المكونات 13 ، 14 ، 15 . صورة مناسبة استجابة نانوكاريرز سيرنا هي مناسبة بشكل مثالي للتغلب على هذه السلبيات وتوفير نهج أبسط وأكثر قوة لتعديل سباتيوتيمبورالي التعبير الجيني 16 ، 17 ، 18 . لسوء الحظ، وأساليب التنبؤ بدقة استجابة البروتين ضربة قاضية الناتجة لا تزال بعيد المنال.
التحدي الرئيسي هو أن التقييمات الكمية لإطلاق سيرنا هينادر 19 ، 20 ، وحتى عندما يتم تنفيذ هذه التقييمات، فإنها لم يقترن لتحليلات سيرنا / البروتينات دوران دوران. كل من كمية سيرنا صدر ومثابرة / عمرها هي المحددات الهامة للديناميات إسكات الجينات الناتجة. وبالتالي، فإن الافتقار إلى هذه المعلومات هو فصل رئيسي يمنع التنبؤ الدقيق للجرعة الاستجابة في رني 21 . ومن شأن التصدي لهذا التحدي أن يعجل بصياغة العلاقات المناسبة بين الهيكل والوظيفة في الحواجز النانوية، وأن يقدم معلومات أفضل عن تصاميم المواد البيولوجية 22 . وعلاوة على ذلك، فإن مثل هذه النهج تمكين تطوير بروتوكولات الجرعات سيرنا أكثر فعالية. في محاولة لفهم الاستجابة إسكات ديناميكية، وقد حققت عدة مجموعات النماذج الرياضية من رني 23 ، 24 ، 25 . وكانت هذه الأطرناجحة في توفير رؤى في التغييرات بوساطة سيرنا في التعبير الجيني وتحديد خطوات الحد من معدل 26 . ومع ذلك، تم تطبيق هذه النماذج فقط على نظم تسليم الجينات التجارية (على سبيل المثال ، ليبوفيكتامين وبولي إيثيلينيمين (بي)) التي ليست قادرة على تسيطر الإفراج سيرنا، وتعقيد النماذج قد حدت بشدة من فائدة 27 . هذه العيوب تسلط الضوء على الحاجة غير الملباة للمواد الجديدة قادرة على الافراج عن سيرنا قابل للتعديل بدقة جنبا إلى جنب مع النماذج الحركية التنبؤية مبسطة وسهلة الاستخدام.
أسلوبنا يعالج كل هذه التحديات من خلال دمج منصة حساسة للضوء نانوكارير مع أساليب مقترنة لتحديد سيرنا الحرة وديناميات نموذج رني. على وجه الخصوص، يتم التحكم في منصة لدينا سيرينا بالتحكم بدقة الإفراج 28 من قبل اثنين من الطرق التكميلية لقياس بدقة مغلفة مقابل الامم المتحدةملزمة سيرنا. يتم إدخال البيانات التجريبية من هذه المقايسات في نموذج حركي بسيط للتنبؤ الكفاءة إسكات الجينات مسبقا 29 . وأخيرا، فإن طبيعة تشغيل / إيقاف نانوكاريرز بسهولة استغلالها لتوليد أنماط الخلايا في التعبير الجيني مع التحكم المكاني على نطاق طول الخلوية. وهكذا، فإن هذه الطريقة توفر طريقة قابلة للتكيف بسهولة للسيطرة والتنبؤ إسكات الجينات في مجموعة متنوعة من التطبيقات التي من شأنها أن تستفيد من التنظيم المكاني الزماني للسلوك الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك خطوات قليلة في الطريقة التي تعتبر حاسمة بشكل خاص. عند صياغة نانوكاريرز، ترتيب إضافة عنصر وسرعة الخلط هما معلمات هامة تؤثر على فعالية 39 . يتطلب هذا البروتوكول أن المكون الموجبة، MPEG- ب -P (أبنبا)، يضاف إلى عنصر أنيوني، سيرنا، بطريقة قطرة بينما فورت?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة في المعاهد الوطنية للصحة (نيه) على الدعم المالي من خلال جائزة التنمية المؤسسية (إيديا) بموجب المنحة رقم P20GM103541 وكذلك رقم المنحة P20GM10344615. ولا تعكس البيانات الواردة في هذه الوثيقة آراء المعاهد الوطنية للصحة. ونعترف أيضا بمعهد ديلاوير للتكنولوجيا الحيوية (ديبي) ومكتب التنمية الاقتصادية في ديلاوير (ديدو) للحصول على الدعم المالي من خلال جائزة مركز العلوم البيولوجية للتكنولوجيا المتقدمة (بيوسينس كات) (12A00448).
Materials
| siRNA | Sigma-Aldrich | SIC001 | non-targeted, universal negative control |
| mPEG-b-P(APNBMA) | synthesized in our lab | N/A | photo-responsive polymer |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| rubber gasket | McMaster-Carr | 3788T21 | 0.5 mL thick |
| UV laser | Excelitas Technologies | Omnicure S2000 | collimating lens and 365 nm filter used |
| agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| siRNA labelled with Dy547 | GE Healthcare Dharmacon, Inc. | custom order | fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand |
| microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | pre-cleaned glass |
| Secure-Seal Spacer | Life Technologies | S24735 | double-sided adhesive |
| LSM 780 | Carl Zeiss | N/A | confocal microscope |
| ZEN 2010 | Carl Zeiss | N/A | FCS analysis software |
| MATLAB | MathWorks | N/A | programming language |
| NIH/3T3 cells | ATCC | ATCC CRL-1658 | |
| DMEM | Mediatech | 10-013-CV | growth media |
| fetal bovine serum | Mediatech | 35-011-CV | heat-inactivated |
| penicillin-streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 11058021 | transfection media |
Referencias
- Forbes, D. C., Peppas, N. A. Oral delivery of small RNA and DNA. J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7291), 1067-1070 (2010).
- Bouchie, A. Companies in footrace to deliver RNAi. Nat Biotechnol. 30 (12), 1154-1157 (2012).
- Burke, P. A., Pun, S. H., Reineke, T. M. Advancing Polymeric Delivery Systems Amidst a Nucleic Acid Therapy Renaissance. ACS Macro Lett. 2 (10), 928-934 (2013).
- Gooding, M., Browne, L. P., Quinteiro, F. M., Selwood, D. L. siRNA Delivery: From Lipids to Cell-penetrating Peptides and Their Mimics. Chem Biol Drug Des. 80 (6), 787-809 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411 (6833), 107-110 (2001).
- Saltzman, W. M., Olbricht, W. L. Building drug delivery into tissue engineering. Nat Rev Drug Discov. 1 (3), 177-186 (2002).
- Mura, S., Nicolas, J., Couvreur, P. Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery. Nat Mater. 12 (11), 991-1003 (2013).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Stimuli-responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications. Adv Drug Delivery Rev. 64 (11), 1046-1058 (2012).
- Kelley, E. G., Albert, J. N. L., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Stimuli-responsive copolymer solution and surface assemblies for biomedical applications. Chem Soc Rev. 42 (17), 7057-7071 (2013).
- Weber, W., Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat Rev Genet. 13 (1), 21-35 (2012).
- Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Huschka, R., et al. Gene Silencing by Gold Nanoshell-Mediated Delivery and Laser-Triggered Release of Antisense Oligonucleotide and siRNA. ACS Nano. 6 (9), 7681-7691 (2012).
- Li, H. -. J., Wang, H. -. X., Sun, C. -. Y., Du, J. -. Z., Wang, J. Shell-detachable nanoparticles based on a light-responsive amphiphile for enhanced siRNA delivery. R Soc Chem Adv. 4 (4), 1961-1964 (2014).
- Braun, G. B., et al. Laser-Activated Gene Silencing via Gold Nanoshell-siRNA Conjugates. ACS Nano. 3 (7), 2007-2015 (2009).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nat Biotechnol. 33 (8), 870-876 (2015).
- Roth, C. M. Quantitative measurements and rational materials design for intracellular delivery of oligonucleotides. Biotechnol Prog. 24 (1), 23-28 (2008).
- Mao, S., et al. Influence of polyethylene glycol chain length on the physicochemical and biological properties of poly(ethylene imine)-graft-poly(ethylene glycol) block copolymer/SiRNA polyplexes. Bioconjugate Chem. 17 (5), 1209-1218 (2006).
- Raab, R. M., Stephanopoulos, G. Dynamics of gene silencing by RNA interference. Biotechnol Bioeng. 88 (1), 121-132 (2004).
- Cuccato, G., et al. Modeling RNA interference in mammalian cells. BMC Systems Biology. 5, 1 (2011).
- Varga, C. M., Hong, K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of synthetic gene delivery vector design properties. Mol Ther. 4 (5), 438-446 (2001).
- Chen, H. H., et al. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum Dot-FRET. Mol Ther. 16 (2), 324-332 (2008).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Res. 34 (1), 322-333 (2006).
- Foster, A. A., Greco, C. T., Green, M. D., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Light-Mediated Activation of siRNA Release in Diblock Copolymer Assemblies for Controlled Gene Silencing. Adv Healthc Mater. 4 (5), 760-770 (2015).
- Greco, C. T., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Mechanistic Design of Polymer Nanocarriers to Spatiotemporally Control Gene Silencing. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1582-1594 (2016).
- Green, M. D., et al. Catch and release: photocleavable cationic diblock copolymers as a potential platform for nucleic acid delivery. Polym Chem. 5 (19), 5535-5541 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Marquer, C., Leveque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J Vis Exp. (62), (2012).
- Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J Vis Exp. (120), e54756 (2017).
- Buyens, K., et al. Monitoring the disassembly of siRNA polyplexes in serum is crucial for predicting their biological efficacy. J Control Release. 141 (1), 38-41 (2010).
- Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad. Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification. Biotechniques. 54 (6), 314-320 (2013).
- Cho, S. K., Dang, C., Wang, X., Ragan, R., Kwon, Y. J. Mixing-sequence-dependent nucleic acid complexation and gene transfer efficiency by polyethylenimine. Biomater Sci. 3 (7), 1124-1133 (2015).
- Liu, Y. M., Reineke, T. M. Poly(glycoamidoamine)s for gene delivery: Stability of polyplexes and efficacy with cardiomyoblast cells. Bioconjugate Chem. 17 (1), 101-108 (2006).
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Greco, C. T., Muir, V. G., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Efficient tuning of siRNA dose response by combining mixed polymer nanocarriers with simple kinetic modeling. Acta Biomater. 50, 407-416 (2017).
