Prévoir le silencieux des gènes grâce au contrôle spatiotemporel de la libération de siRNA de Nanocarriers polymériques adaptés à la photo
Summary
Nous présentons une nouvelle méthode qui utilise des copolymères à blocs photo-réactifs pour un contrôle spatiotemporel plus efficace de l'inhibition des gènes sans effets détectables hors cible. En outre, des changements dans l'expression des gènes peuvent être prédits en utilisant des essais de libération de siRNA simples et une modélisation cinétique simple.
Abstract
De nouveaux matériaux et méthodes sont nécessaires pour mieux contrôler la liaison et la libération d'acides nucléiques pour une large gamme d'applications nécessitant une régulation précise de l'activité des gènes. En particulier, les nouveaux matériaux réactifs aux stimuli avec un contrôle spatiotemporal amélioré de l'expression des gènes ouvraient des plateformes traduisibles dans les technologies de découverte de médicaments et de médecine régénératrice. En outre, une capacité améliorée à contrôler la libération d'acide nucléique à partir de matériaux permettrait le développement de méthodes simplifiées pour prédire l'efficacité des nanocarrières a priori , ce qui entraînerait un dépistage accéléré des véhicules de livraison. Dans ce document, nous présentons un protocole pour prédire l'efficacité du silence génétique et la réalisation d'un contrôle spatio-temporel sur l'expression des gènes grâce à un système nanocarrier modulaire photo-sensible. Le petit ARN interférant (siRNA) est complexé avec du mPEG- b- poly (méthacrylate de 5- (3- (amino) propoxy) -2-nitrobenzyle) (mPEG- b- P (APNBMA)) pourRm stable nanocarriers qui peuvent être contrôlés avec la lumière pour faciliter l'accordable, on / off siRNA version. Nous décrivons deux tests complémentaires utilisant la spectroscopie de corrélation de fluorescence et l'électrophorèse sur gel pour une quantification précise de la libération de siRNA à partir de solutions imitant les environnements intracellulaires. L'information obtenue à partir de ces dosages a été incorporée dans un modèle cinétique simple d'ARN (RNAi) pour prédire les réponses dynamiques au silence à diverses conditions de photo-stimulus. À leur tour, ces conditions d'irradiation optimisées ont permis de raffiner un nouveau protocole pour la régulation spatiotemporelle du silence des gènes. Cette méthode peut générer des modèles cellulaires dans l'expression des gènes avec une résolution cellule-à-cellule et aucun effet détectable hors cible. Ensemble, notre approche offre une méthode facile à utiliser pour prédire les changements dynamiques dans l'expression des gènes et contrôler avec précision l'activité des siARN dans l'espace et le temps. Cet ensemble de tests peut être facilement adapté pour tester une grande variété d'otSes systèmes stimuli-réactifs afin de relever les principaux défis pertinents à une multitude d'applications dans la recherche biomédicale et la médecine.
Introduction
Les petits ARN interférants (siRNAs) servent de médiateur au dépistage génétique post-transcriptionnel à travers une voie catalytique RNAi hautement spécifique, puissante et adaptable à pratiquement n'importe quel gène cible 1 . Ces caractéristiques prometteuses ont permis aux thérapeutiques de siRNA de progresser dans des essais cliniques humains pour le traitement de nombreuses maladies, dont le mélanome métastatique et l'hémophilie 2 , 3 . Cependant, des problèmes de livraison importants persistent qui ont entravé la traduction 4 . En particulier, les véhicules de livraison doivent rester stables et protéger les ARNs par dégradation extracellulaire, mais aussi libérer la charge utile dans le cytoplasme 5 . En outre, de nombreuses applications RNAi nécessitent des méthodes améliorées pour réguler le silence des gènes dans l'espace et le temps 6 , ce qui réduira les effets secondaires chez siRNA therapeutics 7 et permettra de transformer unDvances dans des applications allant des microarrays cellulaires pour la découverte de médicaments 8 à la modulation des réponses cellulaires dans les échafaudages régénératifs 9 . Ces défis mettent en évidence la nécessité de nouveaux matériaux et méthodes pour mieux contrôler la liaison et la libération dans les nanocarriers siRNA.
L'une des stratégies les plus prometteuses pour contrôler la libération de l'ARNi et l'amélioration de la régulation spatiotemporelle est l'utilisation de matériaux sensibles aux stimuli 10 . Par exemple, une grande variété de biomatériaux ont été conçus avec une affinité variable de liaison aux acides nucléiques en réponse à un potentiel ou pH rédox altéré, ou des champs magnétiques appliqués, des ultrasons ou de la lumière 11 . Bien que bon nombre de ces systèmes démontrent un contrôle amélioré de l'activité des acides nucléiques, l'utilisation de la lumière comme déclencheur est particulièrement avantageuse en raison de sa réponse temporelle instantanée, de sa résolution spatiale précise et de sa facilité d'accessibilité <suP class = "xref"> 12. En outre, le potentiel des technologies photo-sensibles pour la régulation de l'expression des gènes a été démontré par des systèmes inducteurs inducibles et des systèmes de régulation optogénétique à la fine pointe de la technologie; Cependant, ces systèmes souffrent de nombreux défis, y compris des capacités limitées pour réguler les gènes endogènes, des problèmes de sécurité tels que l'immunogénicité et les difficultés à fournir des assemblages multi-composants 13 , 14 , 15 . Les nanocarriers de siRNA sensibles à la photo sont idéalement adaptés pour surmonter ces inconvénients et fournir une approche plus simple et plus robuste de l'expression des gènes spatiotemportement modulables 16 , 17 , 18 . Malheureusement, les méthodes pour prédire avec précision la réponse de knockdown protéique résultante demeurent insaisissables.
Un défi majeur est que les évaluations quantitatives de la publication de siRNA sontRares 19 , 20 , et même lorsque ces évaluations sont effectuées, elles n'ont pas été couplées aux analyses de la dynamique du renouvellement des siRNA / protéines. La quantité de siRNA libérée et sa persistance / durée de vie sont des déterminants importants de la dynamique de suppression des gènes qui en résulte; Par conséquent, l'absence d'une telle information est une déconnexion majeure qui empêche une prédiction précise de la dose-réponse dans l'ARNm 21 . Répondre à ce défi permettrait d'accélérer la formulation des relations structure-fonction appropriées dans les nanocarriers et de mieux informer les modèles de biomatériau 22 . En outre, de telles approches permettraient le développement de protocoles de dosage de siRNA plus efficaces. Dans une tentative de comprendre la réponse au silence silencieux, plusieurs groupes ont étudié des modèles mathématiques de RNAi 23 , 24 , 25 . Ces cadres étaientA réussi à fournir des informations sur les changements de l'expression des gènes médiés par un siARN et l'identification des étapes de limitation du taux 26 . Cependant, ces modèles ont été appliqués uniquement aux systèmes commerciaux de distribution de gènes ( p . Ex. , La lipoprotéine et la polyéthylénimine (PEI)) qui ne sont pas capables de la libération si-ARN contrôlée et la complexité des modèles a considérablement limité leur utilité 27 . Ces lacunes mettent en évidence un besoin non satisfait de nouveaux matériaux capables d'obtenir une version de siRNA à réglage précis combinée à des modèles cinétiques prédictifs simplifiés et faciles à utiliser.
Notre méthode aborde tous ces défis grâce à l'intégration d'une plate-forme nanocarrier sensible à la lumière avec des méthodes couplées pour quantifier la dynamique de l'ARNi siRNA et du modèle. En particulier, la version de siRNA 28 contrôlée avec précision de notre plate-forme est surveillée par deux méthodes complémentaires pour quantifier avec précision encapsulated vs. unUn siRNA lié. Les données expérimentales de ces essais sont entrées dans un modèle cinétique simple pour prédire l'efficacité du silence génétique a priori 29 . Enfin, la nature marche / arrêt des nanocarriers est facilement exploitée pour générer des modèles cellulaires dans l'expression des gènes avec un contrôle spatial sur l'échelle de longueur cellulaire. Ainsi, cette méthode fournit une méthode facilement adaptable pour contrôler et prédire le silence des gènes dans une variété d'applications qui bénéficieraient de la régulation spatiotemporelle du comportement cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a quelques étapes dans la méthode qui sont particulièrement critiques. Lors de la formulation des nanocarriers, l'ordre de l'addition des composants et de la vitesse de mélange sont deux paramètres importants influençant l'efficacité 39 . Ce protocole nécessite que la composante cationique, mPEG- b -P (APNBMA), soit ajoutée à la composante anionique, siARN, de manière goutte à goutte lors du vortex. Selon le volume total de la formulation, ce processus de mé…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient l'Institut national des sciences médicales générales des Instituts nationaux de santé (NIH) pour le soutien financier par le biais d'un Prix de développement institutionnel (IDeA) sous le numéro de délivrance P20GM103541 ainsi que le numéro de subvention P20GM10344615. Les énoncés présentés ne reflètent pas les points de vue du NIH. Nous reconnaissons également le Delaware Biotechnology Institute (DBI) et le Deloware Economic Development Office (DEDO) pour le soutien financier grâce au prix Bioscience Center for Advanced Technology (Bioscience CAT) (12A00448).
Materials
| siRNA | Sigma-Aldrich | SIC001 | non-targeted, universal negative control |
| mPEG-b-P(APNBMA) | synthesized in our lab | N/A | photo-responsive polymer |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| rubber gasket | McMaster-Carr | 3788T21 | 0.5 mL thick |
| UV laser | Excelitas Technologies | Omnicure S2000 | collimating lens and 365 nm filter used |
| agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| siRNA labelled with Dy547 | GE Healthcare Dharmacon, Inc. | custom order | fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand |
| microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | pre-cleaned glass |
| Secure-Seal Spacer | Life Technologies | S24735 | double-sided adhesive |
| LSM 780 | Carl Zeiss | N/A | confocal microscope |
| ZEN 2010 | Carl Zeiss | N/A | FCS analysis software |
| MATLAB | MathWorks | N/A | programming language |
| NIH/3T3 cells | ATCC | ATCC CRL-1658 | |
| DMEM | Mediatech | 10-013-CV | growth media |
| fetal bovine serum | Mediatech | 35-011-CV | heat-inactivated |
| penicillin-streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 11058021 | transfection media |
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