Scansione retrovirale: Mappatura dei siti di integrazione MLV per definire regioni regolatori specifiche per le cellule
Summary
Qui descriviamo un protocollo per la mappatura genomica dei siti di integrazione dei vettori retrovirali basati su virus della leucemia murina Moloney nelle cellule umane.
Abstract
I vettori retrovirali a base virale di leucemia murina Moloney (MLV) si integrano prevalentemente in promotori e promotori acetilati. Per questo motivo, i siti di integrazione di mLV possono essere utilizzati come marcatori funzionali di elementi regolatori attivi. Qui presentiamo uno strumento di scansione retrovirale, che consente la identificazione genica di promotori e promotori specifici delle cellule. In breve, la popolazione di cellule bersaglio viene trasdotta con un vettore derivato da mLV e il DNA genomico viene digerito con un enzima di restrizione a taglio frequente. Dopo la legatura di frammenti genomici con un linker DNA compatibile, la reazione a catena di polimerasi mediata da linker (LM-PCR) consente l'amplificazione dei giunti del genoma del virus-ospite. La sequenza massiccia degli ampliconi viene utilizzata per definire il profilo di integrazione mLV in tutto il genoma. Infine, sono definiti cluster di integrazioni ricorrenti per identificare regioni regolatori specifiche per le cellule, responsabili dell'attivazione di programmi transcrizionali specifici di tipo cellulare.
<p class= "Jove_content"> Lo strumento di scansione retrovirale consente l'individuazione genomica di promotori e promotori specifici di cellule in popolazioni di cellule bersaglio di tipo prospetticamente isolato. In particolare, la scansione retrovirale rappresenta una tecnica strumentale per l'identificazione retrospettiva di rari popolazioni ( ad esempio cellule staminali somatiche) che non dispongono di marcatori robusti per l'isolamento prospettico.Introduction
L'identità cellulare è determinata dall'espressione di set specifici di geni. Il ruolo degli elementi cis-regolatori, come promotori e promotori, è fondamentale per l'attivazione di programmi transcrizionali specifici di tipo cellulare. Queste regioni regolatrici sono caratterizzate da caratteristiche specifiche di cromatina, quali modificazioni peculiari dell'istone, fattori di trascrizione e co-fattori legati e accessibilità cromatica, che sono stati ampiamente utilizzati per la loro identificazione a livello genomico in diversi tipi di cellule 1 , 2 , 3 . In particolare, il profilo genomico di acetilazione della istina H3 lisin 27 (H3K27ac) è comunemente usato per definire promotori attivi, enhancer e super-enhancer 4 , 5 , 6 .
Moloney virus della leucemia murina (MLV) è un retrovirus gamma che è ampiamente usato per il geneTrasferimento in cellule di mammiferi. Dopo l'infezione di una cellula bersaglio, il genoma RNA retrovirale viene retro-trascritto in una molecola del DNA a doppio filamento che lega le proteine virali e cellulari per assemblare il complesso di pre-integrazione (PIC). Il PIC entra nel nucleo e lega la cromatina della cellula ospite. Qui, l'integasi virale, un componente chiave del PIC, media l'integrazione del DNA provirale nel genoma delle cellule ospite. MLV nel DNA genomico non è casuale, ma si verifica in elementi cis-regolatori attivi, quali promotori e promotori, in un modo specifico per le cellule 7 , 8 , 9 , 10 . Questo particolare profilo di integrazione è mediato da un'interazione diretta tra l'integrasi di mLV e le proteine cellulodiche del bromodomano e del dominio extraterminale (BET) 11 , 12 , 13 . BET proteine (BRD2, BRD3 eBRD4) agiscono come un ponte tra la cromatina dell'ospite e il mLV PIC: attraverso i loro bromodomi riconoscono regioni cis-regolatori altamente acetilizzate, mentre il dominio extraterminale interagisce con la mLV integrase 11 , 12 , 13 .
Qui descriviamo la scansione retrovirale, un nuovo strumento per mappare regioni attive di cis-regolazione in base alle proprietà di integrazione di mLV. In breve, le cellule sono trasdotte con il vettore retrovirale derivato da mLV che esprime il gene reporter del proteine verde fluorescente (eGFP). Dopo l'estrazione genomica del DNA, le giunzioni tra il 3 'lungo ripetizione terminale (LTR) del vettore mLV e il DNA genomico vengono amplificate mediante PCR linker-mediata (LM-PCR) e sequenzialmente massicciamente. MLV sono mappati al genoma umano e le regioni genomiche altamente mirate da mlV sono definite come cluster di siti di integrazione mLV.
Scansione retroviraleNing è stato utilizzato per definire elementi regolatori attivi specifici per le cellule in diverse cellule primarie umane 14 , 15 . MlV co-mappati con promotori e valorificatori epigeneticamente definiti, la maggior parte dei quali conteneva segni attivi di istone, come H3K27ac, e erano specifiche per le cellule. La scansione retrovirale permette l'identificazione genetica degli elementi regolatori del DNA nelle popolazioni cellulari prospetticamente purificate 7 , 14 , nonché nelle popolazioni cellulari definite retrospettivamente, come le cellule staminali di cheratinociti, che non dispongono di marcatori efficaci per l'isolamento prospettico15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui abbiamo descritto un protocollo per la mappatura genomica dei siti di integrazione di mLV, un retrovirus che mira alle regioni di cromatina, contrassegnato epigeneticamente come promotori e promotori attivi. I passi critici e / o le limitazioni del protocollo includono: (i) trasduzione mLV della popolazione cellulare target; (Ii) amplificazione di giunzioni virali-host da parte di LM-PCR; (Iii) recupero di un'alta percentuale di siti di integrazione. I vettori retrovirali basati su mLV trasudano in modo efficien…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Consiglio europeo della ricerca (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), Ministero italiano dell'istruzione, delle università e della ricerca (FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), il Ministero della Salute italiano (Giovani ricercatori Chiamata 2011 GR-2011-02352026) e la Fondazione Imagine Institute (Parigi, Francia).
Materials
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
| Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
| 0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
| PCR grade water | general lab supplier | ||
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
| 6X Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
| Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
| Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
| KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
| HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
Referencias
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