Live-cel beeldvorming van schimmel cellen om modi van binnenkomst en Subcellular Localisatie van antischimmel Plant defensinen te onderzoeken
Summary
Plant defensinen spelen een belangrijke rol in de verdediging van de plant tegen ziekteverwekkers. Voor effectief gebruik van deze antischimmel peptiden als antischimmel gemachtigden, begrijpen hun vervoerswijzen actie (MOA) is van cruciaal belang. Hier, wordt een live-cel beeldvorming beschreven om te bestuderen van kritieke aspecten van de MOA van deze peptiden.
Abstract
Kleine cysteïne-rijke defensinen zijn één van de grootste groepen van host defense peptides aanwezig in alle planten. Veel plantaardige defensinen Exposeren krachtige in vitro antischimmel activiteit tegen een breedspectrum van schimmel ziekteverwekkers en daarom hebben het potentieel om te worden gebruikt als antischimmel gemachtigden in transgene gewassen. Om te benutten het volledige potentieel van de plant defensinen voor ziekten controle, is het van cruciaal belang voor het ophelderen van de mechanismen van de actie (MOA). Met de komst van geavanceerde microscopie technieken, live-cel imaging uitgegroeid tot een krachtig hulpmiddel voor het inzicht in de dynamiek van de antischimmel MOA van plantaardige defensinen. Hier, wordt een confocale microscopie gebaseerd live-cel beeldvorming beschreven met behulp van twee fluorescently geëtiketteerde plant defensinen (MtDef4 en MtDef5) in combinatie met vitale fluorescente kleurstoffen. Deze techniek maakt visualisatie in real time en analyse van de dynamische gebeurtenissen van internalisering van de MtDef4 en MtDef5 in cellen van de schimmel. Nog belangrijker is, is deze test genereert een schat aan informatie, met inbegrip van internalisering kinetiek, wijze van vermelding en subcellular localisatie van deze peptiden. Samen met andere cel biologische hulpmiddelen, hebben deze methoden kritisch inzicht in de dynamiek en de complexiteit van de MOA van deze peptides verstrekt. Deze hulpprogramma’s kunnen ook worden gebruikt om te vergelijken de MOA van deze peptides tegen andere schimmels.
Introduction
Planten hebben zich ontwikkeld van een verfijnde ingeboren immune systeem voor verdediging tegen de microbiële plant ziekteverwekkers1. Zij express talrijke gen gecodeerde host defense peptiden met vermeende antimicrobiële activiteit2. Sterker nog, veel van deze peptiden weergeven antimicrobiële activiteit in vitro3 Defensinen bestaan uit één van de grootste groepen van host defense peptiden in de plant Koninkrijk4. Deze peptiden cysteïne-rijke, kationische Exposeren krachtige groei inhiberende activiteit tegen schimmel en oomycete ziekteverwekkers op micromolar concentraties en vertegenwoordigen een van de eerste regels van verdediging tegen deze ziekteverwekkers5,6. Vanwege hun krachtige antischimmel activiteit, kan de defensinen in agribiotechnological toepassingen voor het genereren van de ziekte resistente gewassen worden benut. Constitutieve overexpressie van verschillende plant defensinen is aangetoond dat verbetering van de ziekteresistentie in de serre en veld tests van transgene gewassen6. Het is belangrijk te ontrafelen van de mechanismen van de actie (MOA) van deze antischimmel peptides om hun potentieel volledig te benutten als effectieve instrumenten voor gewasbescherming. Echter, de MOA voor de defensinen van deze plant zijn slecht begrepen. Huidige bewijs suggereert dat ze verschillende MOA5,6,7,8 vertonen. Sommige defensinen extracellularly handelen op schimmels en gericht op specifieke celwand/plasma membraan resident sfingolipiden, verstoren de membraan integriteit en activeren van cellulaire toxiciteit trajecten9,10,11. Onlangs, echter, antischimmel defensinen die in schimmel cellen translocate zijn ontdekt12,13,14. Sommige van deze defensinen binden aan membraan-ingezeten bioactieve fosfolipiden, vormen van oligomere complexen en permeabilize plasma membranen15,16,17. Zo hebben sommige aspecten van de MOA van plantaardige defensinen zijn opgehelderd. Echter de MOA van plantaardige defensinen waarschijnlijk betrekking hebben op een complexe reeks gebeurtenissen die hebben nog niet geïdentificeerd en geïntegreerd in een uitgebreide model. In het bijzonder, blijft er een grote kloof in ons begrip van de cellulaire doelstellingen van deze peptiden.
Met recente vooruitgang in microscopie technologieën en de ontwikkeling van nieuwe TL sondes, zijn live-cel beeldvormingstechnieken nu vaak gebruikt voor het bestuderen van de MOA van antimicrobiële peptides (ampère). Deze technieken aanvullen gebruikte methoden zoals immunolocalization, atomaire kracht microscopie en elektronenmicroscopie X-ray tomografie18, die meestal voor het analyseren van de gevolgen van antischimmel peptiden voor de morfologie hebben gewerkt en groei van de schimmel cellen met inbegrip van de studie van de integriteit van de celwand, wijzigingen in celpatronen groei/vertakking, evenals plasmamembraan permeabilization en doden. Deze studies hebben echter beperkt tot imaging cellen op een bepaald punt van de tijd na de behandeling met de peptiden in plaats van het uitvoeren van time-lapse imaging op dezelfde cellen te controleren hun dynamische veranderingen in reactie op defensin uitdaging. In de afgelopen jaren heeft gebruik van fluorescently geëtiketteerde peptiden in combinatie met levende cel imaging met behulp van de confocal microscopie Visualisatie in real time van de dynamiek van de AMP-microbe interacties. Beide natuurlijk gezuiverd en chemisch gesynthetiseerde antischimmel peptiden kunnen worden gelabeld met de fluorescerende etiketten (b.v., DyLight, rhodamine, BODIPY of Alexa Fluor gebaseerd kleurstoffen) en rechtstreeks waargenomen tijdens hun interactie met cellen door time-lapse Live-cel imaging. Het gebruik van deze peptiden label is aanzienlijk gestegen van ons begrip van de verschillende aspecten van hun MOA waaronder modus van binnenkomst, subcellular localisatie, intracellulaire mensenhandel, en sites van antischimmel actie binnen levende schimmel cellen 18.
Verschillende studies hebben onlangs aangetoond dat verschillende antischimmel peptiden, met inbegrip van plantaardige defensinen zijn geïnternaliseerd door levende schimmel cellen12,14,19,20. De MOA van deze defensinen waarschijnlijk betrekken interactie met intracellulaire doelen. Onlangs hebben we de schimmeldodende werking van een plant MtDef4 in twee Ascomycota schimmels, Neurospora crassa es Fusarium graminearumdefensin gemeld. MtDef4 werd aangetoond dat het gebruik van verschillende routes voor schimmel cel invoeren en subcellular localisatie in deze schimmels14. Deze studie gebruikt chemisch gesynthetiseerd tetramethyl rhodamine (TAMRA)-label van MtDef4 in combinatie met vitale fluorescente kleurstoffen (membraan-permeant kleurstof, SYTOX Green, de membraan selectieve kleurstof, FM4-64; de cel dood verslaggever kleurstof, propidium jodide) en metabole remmers. Deze analyses aangetoond de kinetiek van de internalisering van de MtDef4, de mechanismen van intracellulair transport en haar subcellular doelstellingen14.
Hier, wordt een protocol voor live-cel geschikt zijn met behulp van de confocal microscopie gepresenteerd. Het protocol maakt gebruik van fluorescently geëtiketteerde peptiden in combinatie met vitale fluorescente kleurstoffen te bestuderen van de plant defensin-schimmel interacties, in het bijzonder, de trajecten van translocatie en de intracellulaire doelstellingen van defensinen in cellen van de schimmel.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie werd een betrouwbare live-cel imaging methodologie met het gebruik van fluorescently geëtiketteerde antischimmel defensinen omschreven te bestuderen van de kinetiek van de internalisering van deze peptiden in schimmel cellen en om hun subcellular doelstellingen te bepalen. Deze methode is een krachtig hulpmiddel voor het visualiseren van de dynamiek van de interactie tussen defensinen en schimmel cellen stoffelijk en ruimtelijk.
Verschillende methoden zijn gebruikt om het onder…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. R. Howard Berg, directeur van de geïntegreerde microscopie faciliteit in de Donald Danforth Plant Science Center, voor zijn leiding en helpen met confocale microscopie. De auteurs hebben geen conflict van belang te verklaren.
Materials
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
| Imaris software | Bitplane | For Image analysis |
Referencias
- Jones, J. D. G., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).
- Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions. Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).
- Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. A. Properties and mechanisms of action of naturally occurring antifungal peptides. Cell. and Mol. Life Sci. 70 (19), 3545-3570 (2013).
- Van der Weerden, N. L., Anderson, M. A. Plant defensins: Common fold, multiple functions. Fungal Biol Rev. 26 (4), 121-131 (2013).
- De Coninck, B., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Modes of antifungal action and in planta functions of plant defensins and defensin-like peptides. Fungal Biol Rev. 26 (4), 109-120 (2013).
- Kaur, J., Sagaram, U. S., Shah, D. Can plant defensins be used to engineer durable commercially useful fungal resistance in crop plants?. Fungal Biol. Rev. 25 (3), 128-135 (2011).
- Vriens, K., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Antifungal plant defensins: Mechanisms of action and production. Molecules. 19 (8), 12280-12303 (2014).
- Sagaram, U. S., Kaur, J., Shah, D. Antifungal plant defensins: Structure-activity relationships, modes of action, and biotech applications. ACS Symp. Ser. 1095, 317-336 (2012).
- Thevissen, K., Francois, I. E. J. A., Aerts, A. M., Cammue, B. P. A. Fungal sphingolipids as targets for the development of selective antifungal therapeutics. Curr. Drug Targets. 6 (8), 923-928 (2005).
- Thevissen, K., Kristensen, H. H., Thomma, B. P. H. J., Cammue, B. P. A., Francois, I. E. J. A. Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins. Drug Discov. Today. 12 (21-22), 966-971 (2007).
- Aerts, A. M., François, I. E. J. A., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins. Cell. Mol. Life Sci. 65 (13), 2069-2079 (2008).
- Van Der Weerden, N. L., Lay, F. T., Anderson, M. A. The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae. J. Biol. Chem. 283 (21), 14445-14452 (2008).
- Lobo, D. S., Pereira, I. B., et al. Antifungal Pisum sativum Defensin 1 Interacts with Neurospora crassa Cyclin F Related to the Cell Cycle. Bioquímica. 46 (4), 987-996 (2007).
- El-Mounadi, K., Islam, K. T., Hernandez-Ortiz, P., Read, N. D., Shah, D. M. Antifungal mechanisms of a plant defensin MtDef4 are not conserved between the ascomycete fungi Neurospora crassa and Fusarium graminearum. Mol. Microbiol. 100 (3), 542-559 (2016).
- Baxter, A. A., et al. The Tomato Defensin TPP3 Binds Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate via a Conserved Dimeric Cationic Grip Conformation To Mediate Cell Lysis. Mol. and Cell. Biol. 35 (11), 1964-1978 (2015).
- Kvansakul, M., et al. Binding of phosphatidic acid by NsD7 mediates the formation of helical defensin-lipid oligomeric assemblies and membrane permeabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, 11202-11207 (2016).
- Poon, I. K. H., et al. Phosphoinositide-mediated oligomerization of a defensin induces cell lysis. eLife. 3, e01808 (2014).
- Muñoz, A., Read, N. D. Live-cell imaging and analysis shed light on the complexity and dynamics of antimicrobial Peptide action. Front. Immunol. 3, 248 (2012).
- Hayes, B. M. E., et al. Identification and mechanism of action of the plant defensin NaD1 as a new member of the antifungal drug arsenal against candida albicans. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (8), 3667-3675 (2013).
- Muñoz, A., Marcos, J. F., Read, N. D. Concentration-dependent mechanisms of cell penetration and killing by the de novo designed antifungal hexapeptide PAF26. Mol. Microbiol. 85 (1), 89-106 (2012).
- Eaton, C. J., et al. The guanine nucleotide exchange factor RIC8 regulates conidial germination through Gα proteins in Neurospora crassa. PLoS One. 7 (10), e48026 (2012).
- Leslie, J. F., Summerell, B. A. . The Fusarium. laboratory manual. , (2006).
- Broekaert, W. F., Terras, F. R. G., Cammue, B. P. A., Vanderleyden, J. An automated quantitative assay for fungal growth inhibition. FEMS Microbiol.Lett. 69 (1-2), 55-59 (1990).
- Sagaram, U. S., et al. Structural and functional studies of a phosphatidic acid-binding antifungal plant defensin MtDef4: Identification of an RGFRRR motif governing fungal cell entry. PLoS One. 8 (12), 1-22 (2013).
- Uchida, M., et al. Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (46), 19375-19380 (2009).
- Nair, R., et al. Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information. Proteins Struct. Funct. Bioinform. 53 (4), 917-930 (2003).
- Scott, M. S., Calafell, S. J., Thomas, D. Y., Hallett, M. T. Refining protein subcellular localization. PLoS Comput. Biol. 1 (6), e66 (2005).
- Shagaghi, N., Bhave, M., Palombo, E., Clayton, A. Revealing the sequence of interactions of PuroA peptide with Candida albicans cells by live-cell imaging. Sci. Rep. 7, 43542 (2017).
