Bitki defensins patojenlere karşı bitki savunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Etkili eylem (MOA) onların mod anlama antifungal ajanları olarak antifungal Bu peptidler kullanımı önemlidir için. Burada, Bu peptidler MOA kritik yönlerini incelemek için canlı hücre görüntüleme yöntemi açıklanmıştır.
Küçük sistein-zengin defensins bir ana savunma peptidler tüm tesislerinde mevcut en büyük grupları vardır. Birçok bitki defensins karşı geniş spektrumlu fungal patojenlerin güçlü vitro mantar önleyici faaliyet gösteren ve bu nedenle potansiyel transgenik antifungal ajanları olarak kullanılmak üzere. Bitki defensins hastalıkların kontrolü için tam potansiyelini koşum için kendi mekanizmaları eylem (MOA) aydınlatmak önemlidir. Gelişmiş mikroskobu teknikleri ortaya çıkmasıyla, canlı hücre görüntüleme bitki defensins antifungal MOA dinamiklerini anlamak için güçlü bir araç haline gelmiştir. Burada, bir temel confocal mikroskobu canlı hücre görüntüleme yöntemi hayati floresan boyalar ile birlikte iki fluorescently etiketli bitki defensins (MtDef4 ve MtDef5) kullanılarak açıklanmıştır. Bu teknik, gerçek zamanlı görüntüleme ve mantar hücreleri içine MtDef4 ve MtDef5 içselleştirilmesi dinamik olayların analizi sağlar. Önemlisi, bu tahlil içselleştirilmesi Kinetik, giriş modunu ve Bu peptidler hücre altı yerelleştirme dahil olmak üzere bilgi hazinesi oluşturur. Diğer hücre biyolojik aracın yanı sıra, bu yöntemler dinamikleri ve Bu peptidler MOA karmaşıklığı önemli anlayışlar hazırladık. Bu araçlar aynı zamanda farklı mantarlar karşı Bu peptidler MOA karşılaştırmak için kullanılabilir.
Bitkiler mikrobiyal bitki patojenleri1karşı savunma için sofistike bir doğuştan gelen bağışıklık sistemi gelişmiştir. Onlar çok sayıda gen kodlanmış konak savunma peptidler sözde antimikrobiyal aktivite2hızlı. Gerçekten de, birçok Bu peptidler antimikrobiyal aktivitesi vitro3görüntüler. Defensins konak savunma peptidler bitki Krallık4en büyük gruplarından birini oluşturmaktadır. Bu sistein-zengin, Katyonik peptidler mantar karşı güçlü büyüme inhibitör etkinliği sergi ve oomycete patojenleri micromolar konsantrasyonları ve bu patojenler5,6karşı savunma ilk satırlardan birini temsil eder. Onların güçlü antifungal etkinlik nedeniyle, defensins hastalığı dayanıklı bitkiler üretmek için agribiotechnological uygulamalarında yararlanılabilir. Birkaç bitki defensins kurucu overexpression transgenik6sera ve alan testlerinde hastalık direnci artırmak için gösterilmiştir. Eylem bu antifungal peptidler (MOA) mekanizmaları tam olarak bitki koruma için etkili araçlar olarak potansiyellerini koşum için çözmek önemlidir. Ancak, bu bitki defensins MOA kötü anlaşılır. Geçerli kanıtlar onlar farklı MOA5,6,7,8sergi gösteriyor. Bazı defensins extracellularly mantarlar hareket ve belirli hücre duvarı/plazma membran ikamet organizmalardandır hedef, membran bütünlüğü bozabilir ve hücresel toksisite yolları9,10,11etkinleştirme. Son zamanlarda, ancak, mantar hücrelere translocate antifungal defensins bulunan12,13,14olmuştur. Bu defensins bazıları membran yerleşik biyoaktif fosfolipitler bağlamak oligomeric kompleksler oluşturur ve plazma membran15,16,17permeabilize. Böylece, bitki defensins MOA bazı yönlerini aydınlatılmamıştır. Ancak, bitki defensins büyük olasılıkla MOA henüz tespit edilmiş ve kapsamlı bir modeli olarak entegre olaylar karmaşık bir dizi içerir. Özellikle, anlayışımız Bu peptidler hücresel hedefler büyük bir boşluk kalır.
Mikroskopi teknolojiler ve yeni floresan problar gelişimi son gelişmeler ile canlı hücre görüntüleme teknikleri şimdi sık sık antimikrobiyal peptidler (Amper) MOA incelemek için kullanılır. Bu teknikler çoğunlukla morfolojisi antifungal peptidler etkilerini çözümlemek için istihdam immunolocalization, elektron mikroskobu, Atomik kuvvet mikroskobu veya x-ışını tomografi18, gibi yaygın olarak kullanılan yöntemleri tamamlayacak ve hücre duvarı bütünlüğü, değişiklikler hücre büyüme/dallanma desenleri, hem de plazma zarı permeabilization çalışmanın da dahil olmak üzere ve öldürmek mantar hücrelerinin büyümesini. Yine de, bu çalışmalar gerçekleştirmek yerine peptidler ile tedavi meydan defensin karşılık dinamik değişiklikleri izlemek için aynı hücrelerde Imaging hızlandırılmış sonra hücreleri belirli bir zaman noktasında Imaging’e sınırlı olmuştur. Son yıllarda fluorescently etiketli peptidler canlı hücre confocal mikroskobu kullanarak Imaging ile birlikte kullanımı gerçek zamanlı görselleştirme AMP-mikrop etkileşimleri dinamikleri sağlamıştır. Her ikisi de doğal olarak saflaştırılmış ve kimyasal olarak sentezlenmiş antifungal peptidler floresan etiketlerle öğesini (örneğin, DyLight, rodamine, BODIPY veya Alexa Fluor esaslı boyalar) ve doğrudan hücrelerle onların etkileşim sırasında hızlandırılmış tarafından gözlenen canlı hücre görüntüleme. Bunlar peptidler etiketli kullanımını önemli ölçüde onların MOA giriş, hücre altı yerelleştirme, hücre içi trafiği ve siteleri mantar önleyici eylem yaşam mantar hücreleri içinde modu dahil olmak üzere farklı yönleri anlayışımız artmıştır 18.
Son zamanlarda, çeşitli çalışmalar bitki defensins de dahil olmak üzere çeşitli antifungal peptidler yaşayan mantar hücreleri12,14,19,20tarafından içselleştirilmiş göstermiştir. Bu defensins büyük olasılıkla MOA etkileşim hücre içi hedefleri olan gerektirir. Son zamanlarda MtDef4 iki ascomycete Mantarlar, Neurospora crassa ve Fusarium graminearumdefensin bir bitkinin antifungal eylem bildirdin. MtDef4 mantar Hücre girişini ve bu mantar14hücre altı yerelleştirme için farklı yolları kullanmak için gösterildi. Tetramethyl rodamine (TAMRA) Bu çalışmada kullanılan kimyasal sentez-hayati floresan boyalar (membran seçici boya, FM4-64; hücre ölüm gazeteci boya, propidium iyodür membran permeant boya, SYTOX yeşil) ile birlikte MtDef4 etiketli ve metabolik inhibitörleri. Bu analizler MtDef4, onun mekanizmaları hücre içi ulaşım ve onun hücre altı hedefleri14içselleştirilmesi Kinetik gösterdi.
Burada, confocal mikroskobu kullanarak canlı hücre görüntüleme için bir protokol sunulmuştur. Protokol fluorescently etiketli peptidler bitki defensin mantar etkileşimleri, özellikle eğitim için hayati floresan boyalar, translocation yollar ile defensins mantar hücrelerinde hücre içi hedefleri ile birlikte kullanır.
Bu çalışmada, bir güvenilir canlı hücre görüntüleme metodoloji fluorescently etiketli antifungal defensins kullanımı ile Bu peptidler içselleştirilmesi mantar hücreleri içine Kinetik çalışmaya ve hücre altı hedefleri belirlemek için tanımlanmıştır. Bu yöntem defensins ve mantar hücreleri arasındaki etkileşimi dinamikleri geçici ve dağınık şekilde görselleştirmek için güçlü bir araçtır.
İçselleştirilmesi ve bitki defensins mantar hücrelerinde hücre…
The authors have nothing to disclose.
Dr. R. Howard Berg, Donald Danforth bitki Bilim Merkezi onun rehberliği için entegre mikroskobu tesis Müdürü teşekkür ediyoruz ve confocal mikroskobu ile yardımcı olur. Yazarlar hiçbir bildirmek için çıkar çatışması var.
FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
SP8-X confocal microscope | Leica | ||
ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
Imaris software | Bitplane | For Image analysis |