הנפוץ ביותר ניתוח תוכן הבטן של macroinvertebrates הם חזותיים. הדורשים ידע אינטנסיבי ונעשית מורפולוגי של אורגניזמים טרף, הם מתגעגעים טרף גוף רך, בשל comminution חזקה של טרף, הם כמעט בלתי אפשרית עבור אורגניזמים מסוימים, כולל amphipods. אנו מספקים נתונים היסטוריים, רומן גישות גנטיות עבור macroinvertebrate טרף זיהוי בתזונה של amphipods.
ניתוח במארג המזון חיוני לצורך הבנה טובה יותר של מערכות אקולוגיות. לדוגמה, אינטראקציות מארג מזון יכול עוברים שינויים חמורה נגרמת על ידי הפלישה של מינים-ילידים. עם זאת, זיהוי מדויק של שדה טורף-טרף אינטראקציות קשה במקרים רבים. ניתוחים אלה לעיתים קרובות מבוססות על בדיקה חזותית של תוכן הבטן או הניתוח של יחסי איזוטופ יציב (אלפא15N ואלפא13ג). שיטות כאלה דורשים ידע מקיף, בהתאמה, גיוון מורפולוגיות או חתימה איזוטרופי של אורגניזמים טרף בודדים, שמוביל מכשולים הזיהוי המדויק של אורגניזמים טרף. ניתוח תוכן ויזואלי הבטן במיוחד לזלזל אורגניזמים טרף גוף רך, כי השרייה, שאורכה, בליעה, העיכול של אורגניזמים טרף להקשות זיהוי של מין מסוים. לפיכך, פולימראז תגובת שרשרת (PCR) המבוסס על אסטרטגיות, למשל השימוש של קבוצה ספציפית פריימר מגדיר, לספק כלי רב עוצמה עבור החקירה של אינטראקציות מארג מזון. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים מפורט כדי לחקור את תכולת הבטן הצרכנים macroinvertebrate מן השדה באמצעות פריימר המיועדות לקבוצות ערכות עבור גרעיני חומצה deoxyribonucleic 30s ריבוזומלי (rDNA). דנ א יכול להיות חילוץ או כל דגימות (במקרה של taxa קטנה) או מתוך הבטן התוכן של דגימות שנאספו בשטח. נוכחות ויעילות פונקציונלי של תבניות DNA צריך לאשר ישירות מן הפרט נבדק באמצעות פריימר אוניברסלי מגדיר פילוח של יחידת משנה בהתאמה של ה-DNA. אנחנו גם להוכיח כי טרף נצרך יכול להיקבע נוספת לרמה מינים באמצעות PCR עם תחל המיועדות לקבוצות שלא שונתה בשילוב עם גדיל אחד העוקבים קונפורמציה פולימורפיזם (SSCP) ניתוחים באמצעות ג’ל לזיהוי. יתר על כן, אנו מראים כי השימוש שונים צבעי פלורסנט כתוויות מאפשר הקרנה מקבילים של שברי DNA של קבוצות שונות טרף מדגימות מרובים בטן תוכן באמצעות ניתוח אוטומטיות רסיס.
אינטראקציות טורף-טרף, המהווים את רוב האינטראקציות עם מחלות ואת הדינמיקה מארג מזון, הם היבטים מרכזיים כדי לאפיין את פלקסים של חומר ואנרגיה ברחבי במארג המזון בתוך ובין מערכות אקולוגיות, אשר אחת ממטרותיה העיקריות של אקולוגיה 1. קביעת מקור וזרימה של פחמן וחומרים מזינים היא בהבנה של קישוריות אקולוגית בין מערכות אקולוגיות2. עם זאת, מערכות אקולוגיות, כגון נהרות, catchments שלהם, לא רק מקושרים על ידי פלקסים של חומר אורגני וחומרים מזינים, אלא גם על ידי התנועות של אורגניזמים3. לפיכך, שינויים הגידול מפריע לזרם של משאבים לקשר מערכות אלה יכול בחום לשנות מזון באתרי אינטרנט של שתי מערכות אקולוגיות, לא רק ישירות אלא בעקיפין גם על-ידי שינוי ההרכב בהתאמה של קהילות טורף-טרף. למשל, שינויים של במארג המזון הוכחו להיות מקושר התנועות של מינים (למשל, פורל הקשת בענן) טורף יחיד4. שינויים כאלה שעלולים לאיים על המגוון הביולוגי לבין תפקוד המערכת האקולוגית הימית. לפיכך, ניתוח אינטראקציות טורף-טרף בשדה חיונית כדי לקבוע את ההשפעה של האדם-induced שינויים סביבתיים, כגון שיטות ניהול מים, על המגוון הביולוגי מקורית של המערכת האקולוגית הימית.
מאחר מעקב אחר קישורים עם מחלות קשות במערכות מורכבות, מספר גישות הוקמו המאפשרים את ההערכה של האכלה אינטראקציות שדה5. באופן מסורתי, חקירות של האכלה אינטראקציות בשדה מבוססים על זיהוי חזותי שרידי טרף במעיים ביתור ודורשים ידע נרחב על הטרף מורפולוגיות הגיוון. ניתוח תוכן ויזואלי בטן סיפקו תובנות על השימוש במשאבים של מספר קבוצות של צרכנים (למשל, וריאציה עונתיים בתזונה של לובסטר6 דגים7,8 או האכלה והעדפות של משטרגליים). עם זאת, התהליך הפיזי של מערכת העיכול מקשה על ניתוח תוכן ויזואלי בטן ומתגעגעת בדרך כלל גוף רך טרף-אורגניזמים9. עבור מינים האכלה דרך בליעה נוזלי או כמה צרכני הגעה באופן אינטנסיבי comminute את האוכל שלהם לפני בליעה, כמו amphipods, זיהוי חזותי של הטרף מינים בתוכן הבטן הוא בלתי אפשרי10. בשל מגבלות אלו, אנליזה מולקולרית מספק אלטרנטיבה מבטיחה.
ניתוחים מולקולריים הפכו עתה כלי משותף המאפשר זיהוי מהיר ומדויק טרף בתכולת מעיים. מגוון טכניקות אלה הוא מגוונים: אסטרטגיות בהתבסס על נוגדנים חד-שבטיים או תגובות שרשרת של פולימראז (PCR) משמשים לעתים קרובות, בגלל שלהם גבוהה ירידה לפרטים ורגישות11. הפיתוח של נוגדנים חד-שבטיים החדש ואת עלות-אינטנסיבית, לכן, היישום של טכניקות מולקולריות אחרות הוא יותר שימושי כאשר נוגדנים אינם קיימים כבר11. גישה נפוצה אחרת היא ההגברה של מחוזות חומצה deoxyribonucleic (DNA), כמו חומצה ריבונוקלאית 30s ריבוזומלי (RNA) גנים נוכח רוב המינים, באמצעות פריימר אוניברסלי מגדיר12,13. בעת שימוש בטכניקה זו, הוא לעתים קרובות לא ניתן לזהות מגוון רחב של אורגניזמים טרף בתוך מקורות מעורבות של הדנ א14. גישה יעילה כדי להימנע כזה חיסרון הוא להשתמש המיועדות לקבוצות פריימר מגדיר עבור ניתוח תוכן הבטן גנטי. שנועד להגביר רק DNA אזורים של קבוצות יעד מסוים או לא לכלול כל שאר המינים15,16, המיועדות לקבוצות תחל להפעיל זיהוי של אורגניזמים טרף ברמה טקסונומי של הקבוצות שצוין ללא ניתוחים משניים של עלות-אינטנסיבית. עם זאת, כמו כל בטן ניתוח תוכן, ניתוח כזה מספקים רק תמונה של האכלה התנהגות. לכן, שילוב של ניתוח תוכן הבטן מולקולרית עם ניתוחים של שילוב זמן המשדרים טבעי (למשל, איזוטופים היציבים) נחשב מועיל1,2.
כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת חקירות מבוסס ה-PCR של טורף-טרף אינטראקציות באמצעות פריימר המיועדות לקבוצות ערכות עבור גרעיני ribosomal DNA (rDNA) אזורים להיות משולבת עם איזוטופ יציב ניתוחים של הדגימה זהה. אנו מתארים את הגילוי של ה-DNA של קבוצות טרף יחיד באמצעות agarose בג’ל. בנוסף, אנו מציגים הזדמנות נוספת במורד הזרם ניתוחים של מוצרי ה-PCR תחל המיועדות לקבוצות כזה ישים בכל פעם בטקסונומיה ברזולוציה גבוהה יותר מאשר ירידה לפרטים תחל נדרש. כי הדנ א נטושים יחיד (ssDNA) קטעים טופס שלישוני הייצורים החיים שנקבעות על-ידי רצף העיקרי שלהם17, וריאציות קטנות בתוך שברי מוגבר על ידי תחל המיועדות לקבוצות כאלה להוביל שינויים הסתגלותי. שינויים כאלה יכולים יזוהו על-ידי צירוף יחיד קונפורמציה פולימורפיזם (SSCP) ניתוחים עם ג’לים לזיהוי17,18, מתן אפשרות של זיהוי מדויק יותר של הטרף אורגניזמים (עד לרמת מינים).
בעוד agarose בג’ל הוא כלי נפוץ וזול כדי להמחיש שברי DNA ולקבוע שלהם אורך משוער19, הרזולוציה תלוי בכמות ה-DNA ומשמש לצבוע מכתימים20. בדרך כלל, הפריט החזותי הוא ישר קדימה בעת עבודה עם דגימות דנ א טהור, אבל כמויות נמוכות באופן פוטנציאלי של הטרף DNA בתוכן הבטן של הצרכנים יכול לסבך על מניה של agarose ג’ל אלקטרופורזה תוצאות. עדיין, זיהוי שיטה זו אפשרית על המסך מספר נמוך של הצרכן דגימות מן השדה עבור אחד או כמה טרף קבוצות, אך סיבוך על מניה גורם ההקרנה של מספר רב של דוגמאות taxa טרף מרובות מאוד זמן אינטנסיבית ובכך אכן. שיטת זיהוי רגיש יותר הוא ניתוח אוטומטיות של קטעים באמצעות אלקטרופורזה נימי, אשר בנוסף מאפשר קביעת האורך המדויק של שברי21. מספר microsatellite המבוסס על מחקרים הראו כי באמצעות צבעי פלורסנט שונים כמו תוויות, זה אפשרי ויוכל לקבוע שברים שונים של אורך דומות על ידי אוטומטיות רסיס ניתוח22,23, 24. לכן, אנו מציגים גם פרוטוקול מפורט לצורך זיהוי מקבילים של ה-DNA של הטרף מרובים באמצעות PCR עם תוויות ייחודיות לקבוצה פריימר ערכות זיהוי באמצעות ניתוח אוטומטיות רסיס עם ברצף אוטומטיות קבוצות. בנוסף, אנו מציגים תוצאות של חקר מקרה הממחיש זיהוי ה-DNA טרף באמצעות ניתוח אוטומטיות רסיס היא גישה המאפשרת גם על כימות היחסי של הטרף בלע.
כאן, אנו מציגים שיטה קלה וחסכונית עבור נחישות מבוססי ה-PCR של טורף-טרף אינטראקציות מדגימות שדה באמצעות תחל קבוצה ספציפית עבור אזורים rDNA, אשר יכול להיות משולב עם אחרים ניתוחים שאינם-מולקולרית של דגימות באותו. עם זאת, ישנם מספר שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול. ראשית, שמבטיח יחודיות של תחל שימוש ח?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים שערותיו ארוכות ואפורות Classen ממכון המחקר על המערכת האקולוגית ניתוח והערכה (gaiac), RWTH אאכן על הסיוע בהקמת קבוצות ייחודיות לקבוצה פריימר בשימוש בפרוטוקול זה. אנו מודים גם פיטר מרטין, לורה Schynawa מ אוניברסיטת קיל עבור שיתוף הפעולה בניסויים של קרדית מים. אנו מודים גם את אסיסטנטים טכני לצורך שמירת למעבדה תקינה והכנת הקופה של חברות ושל מספרי קטלוג. עבודה זו נתמכה על ידי קרן מחקר גרמני (DFG; פרוייקט ג ‘ נרל אלקטריק 2219/3-1).
liquid nitrogen | Any | NA | For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory. |
1.5 ml reaction tubes – Safelock | Any | NA | For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle. |
Stereomicroscope | Any | NA | Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest. |
Petri dishes | Any | NA | To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope. |
Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 | Bioform | B40d | This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract. |
Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 | Bioform | B40b | This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens. |
DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations |
fuzz-free paper towel | Any | NA | |
Lab scale | Any | NA | Precision needs to be at least 0.01 g. |
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | Any | NA | |
Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
Safe-Lock Tubes 1.5 ml | VWR | 211-2164 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA. |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris | carlroth | 4855.2 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained. |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | carlroth | 4360.1 | For extraction of DNA |
Proteinase K lyophil. | carlroth | 7528.1 | Prepare a working solution containing 10 mg/ml. |
TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Bead mill for homogenization of the samples. |
Stainless Steel Beads, 5 mm | Quiagen | 69989 | For homogenization of samples. |
Heating Thermoshaker | Any | NA | |
Vortex Mixer | Any | NA | |
Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1). |
Isopropanol | carlroth | 6752.5 | |
Ethanol 99.8 %, p.a. | Any | NA | |
Water Molecular biology grade (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript |
Unmodified Olegonucleotides | Eurofins MWG Operon | NA | Primers unlabeled |
Modified olegonucleotides | Metabion International AG | NA | Primers labelled |
peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2) |
Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine. |
Standard 96 Well PCR Plates | VWR Peqlab | 732-2879 | Used for PCR reactions. |
Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap stripes used to close the PCR plates. |
Agarose | Peqlab | 35-1020 | Used for gel electrophoresis. |
Microwave | Any | NA | |
Conical flask | Any | NA | |
Measuring cylinder | Any | NA | |
Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth | Any | NA | For agarose gel electrophoresis. |
Electrophoresis Power Supply PS3002 | Life Technologies | NA | |
Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | Used to prepare staining bath for agarose gels. |
Formamide | carlroth | 6749.1 | Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses. |
Bromphenol blue | AppliChem | A3640.0010 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
Sucrose | carlroth | 4621.1 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | As size standard for agarose gel electrophoresis. |
UV-Documentation system | Any | NA | To visualize gel electrophoresis results. |
Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
Ammonium peroxydisulphate | carlroth | 9592.2 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
foldback clips (32 mm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
Beaker | Any | NA | |
RC 10 Digital chiller | VWR | 462-0138 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
Notched glass plate | VWR | 730-0261 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
Blank glass plate | VWR | 730-0260 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
Spacers | VWR | 730-0262 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
Comb with 25 teeth | VWR | 730-0294 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
Shaking platform | Any | NA | For constant shaking of the staining bath. |
GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | For staining of polyacrylamide gels. |
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B. |
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A. |
Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | For automated fragment analyses. |
Sequenzing plate – 96 Well Polypropylene PCR Microplate | Costar | 6551 | For automated fragment analyses. |
Plate centrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini plate centrifuge used to spin down PCR products. |
Buffer plate – 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 9017 | For automated fragment analyses. |
GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | For automated fragment analyses. |
Separation Gel – LPAI | AB Sciex | 608010 | For automated fragment analyses. |
Sequenzer – CEQ8000 Genetic Analysis System | Beckman Coulter | NA | For automated fragment analyses. |
GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | To analyze results of automated fragment analyses. |