تقييم نفاذية حاجز الدم في الدماغ بالتسريب الوريدي الزلال المسمى فيتك في نموذج ماوس لأمراض الأعصاب
Summary
في هذه الدراسة، نقدم إجراءات سهلة وفعالة لتقييم اضطراب حاجز الدم في الدماغ تحت ظروف الأعصاب. ولتحقيق هدفنا، نحن غرست عالية الوزن الجزيئي fluorescein isothiocyanate المسمى (فيتك)-الزلال في الماوس حبل الوريد وتقييمها التسرب إلى حمة الدماغ بالفحص المجهري الأسفار.
Abstract
الإخلال بسلامة حاجز الدم في الدماغ (BBB) سمة مشتركة لمختلف الأمراض العصبية والأعصاب. على الرغم من أن التفاعل بين القلق BBB التوازن والآلية المرضية لاضطرابات الدماغ يحتاج إلى مزيد من التحقيق، تطوير والتحقق من صحة إجراءات موثوقة لدقة الكشف عن التعديلات BBB قد تكون حاسمة وتمثل أداة مفيدة للتنبؤ باحتمال المرض تستهدف التقدم وتطوير استراتيجيات علاجية.
نقدم هنا، إجراءات سهلة وفعالة لتقييم BBB التسرب في حالة حدوث مثل هذا في نموذج ماوس الإكلينيكية لمرض هنتنغتون، فيها عيوب في نفاذية BBB قابلة للاكتشاف وضوح بريكوسيوسلي في الأعصاب هذا المرض. على وجه التحديد، ارتفاع الوزن الجزيئي fluorescein isothiocyanate المسمى (فيتك)-الزلال، التي قادرة على عبور BBB فقط عندما يكون هذا الأخير البصر، التي غرست حادة في الوريد ماوس وتوزيعها في مناطق الأوعية الدموية أو متني ثم تحددها مجهرية الأسفار.
تراكم الزلال الفلورية الخضراء في حمة الدماغ يعمل كمؤشر الشاذة BBB النفاذية، وعندما كوانتيتاتيد باستخدام برامج معالجة “الصورة ي”، يتم الإعلام عن “كثافة الفلورية الخضراء”.
Introduction
التوازن داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS) شرط أساسي للاتصال السليم ووظيفة الخلايا العصبية. حمة الجهاز العصبي المركزي هو محكم أغلقت من الهامش ببطانية حاجز الدم في الدماغ (بي بي بي)، الذي يمثل الواجهة بين مجرى الدم المحيطي والدماغ، وتلعب دوراً محوريا في عبر الحديث بين هاتين المنطقتين1 ،2. BBB معقدة ودينامية بنية ثلاثية الأبعاد تتألف أساسا من السفينة الصغيرة غشائي الخلايا المتخصصة (ECs) مرتبطة ببعضها البعض عن طريق المجمعات هالة بين الخلايا-تقاطعات ضيق (TJs)-وهو محاط بيريسيتيس، العصبية النهايات و astrocyte القدم العمليات1،2.
في ظل الظروف الفسيولوجية، نفاذية منخفضة للغاية من BBB سليمة يضمن التنظيم الصارم لنقل المواد الغذائية والجزيئات الأخرى داخل وخارج الدماغ، ويوفر الجهاز العصبي المركزي مع حماية فريدة من نوعها من التغيرات التي تحدث في تكوين الدم التي قد تؤثر على النشاط العصبي وضد احتمال الطرفية الشتائم1،،من23.
الإخلال بسلامة BBB ونفاذيه معززة فترة طويلة كان معروفا لتشكل إحدى سمات رئيسية للعديد من العصبية واضطرابات الأعصاب4 بما في ذلك مرض هنتنغتون (HD)5،6، ومع ذلك ، ما إذا كان مثل هذا خلل ظاهرة المسبّب للمرض أو حدثاً معوي أثناء المرض لا يزال غير واضح. توقيت انهيار BBB أيضا لا يزال بعيد المنال، بيد أن تبرز أدلة من مجموعتنا وغيرها تشير إلى أن تعطل BBB وحدة لا يمثل الراحل حدثاً في تطور المرض، ولكن بدلاً من ذلك خطوة مبكرة6،7 , 8، والتي قد تكون لها آثار طويلة الأجل.
مع هذا في الاعتبار، من المهم أن بريكوسيوسلي تكشف عن انهيار BBB في نيوروديجينيريشن من أجل وضع استراتيجيات مفيدة للتنبؤ بتطور المرض وتلف الدماغ وتطوير التدخلات البديلة وأكثر استهدافاً قادر على بنجاح التخفيف من آثار هذه إلى اضطراب السريرية. تصوير موثوق بها من ضعف BBB ولذا، ذات أهمية كبيرة في البحوث التجريبية والمعالجة السريرية لأمراض المخ.
في هذه الورقة، يصف لنا إجراء ناجح وبسيطة لتقييم نفاذية BBB في طراز ماوس عالية الدقة باستخدام ارتفاع الوزن الجزيئي fluorescein isothiocyanate المسمى الزلال (فيتك الزلال). وتم قياس التسرب الزلال فيتك، التي عادة لا يمكن عبور الحاجز، إلى حمة الدماغ كمؤشر التسرب بي بي بي. هذا الأسلوب سهولة التكيف للفئران وغيرها من الحالات المرضية التي تتميز بضعف سيريبروفاسكولاتوري9،10.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأسلوب الذي يصف لنا هنا أساسا مفيداً للكشف عن التسرب BBB ظروف مرض المخ. الخلل بي بي بي يكتسب اهتماما كسمة مشتركة من اضطرابات عصبية متنوعة4. كنا سابقا هذا النهج لوصف الاختلال المبكر BBB السلامة في طراز ماوس من مرض الأعصاب نادرة مثل HD6.
يأخذ هذا الأسلوب م…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها “مؤسسة نيوروميد” وتموله وزارة الصحة “كورينتي ريشيركا” إلى عين الإيطالية
Materials
| Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
| iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health &Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
| Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medical patch | Medicalis | 34788 | |
| Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
| Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
| Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
| Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
Referencias
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
- Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
- Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40 (2015).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington’s disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
- Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316 (2017).
- Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
- van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615 (2017).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
- Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
- Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).
- Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease. Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).
