Оценка проницаемости гематоэнцефалического барьера путем внутривенного вливания FITC-меченых альбумина в мышиной модели нейродегенеративные заболевания
Summary
В этом исследовании мы представляем простой и эффективной процедуры оценки нарушения blood – brain барьер нейродегенеративных условиях. Для достижения нашей цели, мы проникнуты высокомолекулярного флуоресцеин Изотиоцианаты маркировку (FITC)-альбумина в мыши яремной вены и оценку его утечки в паренхиме мозга микроскопии флуоресцирования.
Abstract
Нарушение целостности гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является общей особенностью для различных неврологических и нейродегенеративных заболеваний. Хотя взаимодействие возмущенных BBB гомеостаза и патогенез расстройств головного мозга требует дальнейшего расследования, разработки и проверки надежные процедуры точно обнаруживать изменения BBB может иметь решающее значение и представляют собой полезный инструмент для потенциально прогноза болезни прогрессирования и развития целевых терапевтических стратегий.
Здесь мы представляем простой и эффективной процедуры для оценки утечки BBB в состоянии нейродегенеративных подобное происходит в доклинических мыши модели болезни Гентингтона, в котором дефекты проницаемости BBB четко обнаруживаются благосклонностью в болезнь. В частности, высокой молекулярной массой флуоресцеин Изотиоцианаты маркировку (FITC)-альбумин, который способен пересечь BBB только тогда, когда последний нарушается, остро проникнуты в яремной мышь и ее распространение в районах сосудистой или Паренхиматозный Затем определяется микроскопии флуоресцирования.
Накопление Зеленый флуоресцентный-альбумина в паренхиме мозга функционирует как индекса проницаемости аберрантных BBB и, когда предел с помощью программного обеспечения для обработки изображений J, сообщается как зеленый интенсивности флуоресценции.
Introduction
Гомеостаз в пределах центральной нервной системы (ЦНС) является необходимым условием для надлежащей коммуникации и функции клеток-нейронов. Паренхима ЦНС плотно запечатан от периферии эндотелиальной гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), который представляет собой интерфейс между периферической крови и мозг и играет ключевую роль в кросс разговор между этими двумя районами1 ,2. BBB – это комплекс и динамических трехмерной структуры в основном состоит из специализированных микро судно эндотелиальных клеток (ECs) связаны друг с другом через межклеточное соединительной комплексы – плотные соединения (сомони) – и окруженный pericytes, нейрон окончаний и экзоцитоз ног процессов1,2.
В физиологических условиях, крайне низкая проницаемость нетронутыми BBB обеспечивает строгое регулирование транспорта питательных веществ и других молекул в и из мозга и ЦНС с уникальной защитой от изменений, происходящих в состав крови, что может повлиять на нейронной активности и против потенциал периферийных оскорбляет1,2,3.
Нарушения целостности BBB и его повышение проницаемости давно известно, являются ключевым элементом для многих неврологических и нейродегенеративных расстройств4 включая болезни Гентингтона (HD)5,6, однако , является ли такая дисфункция причинные явления или распространение событий в ходе заболевания до сих пор неясно. Сроки BBB разбивка также остается недостижимой, однако, новые доказательства нашей группы и другие указывает, что нарушена целостность BBB не представляют поздно событий в развитие болезни, но довольно рано шаг6,7 , 8, который может иметь долгосрочные последствия.
Имея это в виду важно выявить благосклонностью BBB пробоя в нейродегенеративные для того, чтобы разработать стратегии, полезной для прогнозирования прогрессирования заболевания и повреждения головного мозга и успешно развивать альтернативные и более целенаправленных мероприятий, способных смягчение клинических последствий такого нарушения. Надежные изображений BBB обесценения является, таким образом, важное значение в экспериментальных исследований и клинического управления заболеваний головного мозга.
В этом документе мы описываем успешным и простой процедуры для оценки BBB проницаемости в мышиной модели HD с помощью высокой молекулярной массой флуоресцеин Изотиоцианаты маркировку альбумина (FITC-альбумина). Кровоподтек FITC-альбумина, который обычно не может пересекать барьер, в паренхиме мозга измерялась как индекс BBB утечки. Этот метод легко адаптируется, крысы и другие патологические состояния, характеризуется cerebrovasculature обесценения9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Техника, которую мы опишем здесь главным образом полезен для обнаружения утечки BBB условиях болезнь мозга. BBB дисфункции завоевывает внимание как общей чертой различных неврологических расстройств4. Ранее мы использовали этот подход для описания ранних расстройство BBB цел…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана «Fondazione Neuromed» и финансируется министерством здравоохранения «Ricerca Corrente» для в.м. Италии
Materials
| Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
| iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health &Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
| Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medical patch | Medicalis | 34788 | |
| Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
| Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
| Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
| Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
Referencias
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
- Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
- Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40 (2015).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington’s disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
- Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316 (2017).
- Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
- van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615 (2017).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
- Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
- Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).
- Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease. Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).
