مصل وبلازما نسخة الكشف رقم PCR الوقت الحقيقي باستخدام
Summary
ويصف هذه المخطوطة نسخة رقم تحليل تباين أداؤها في الحمض النووي المصل أو البلازما باستخدام نهج PCR الوقت الحقيقي. هذا الأسلوب مناسبة للتنبؤ بمقاومة الأدوية في مرضى سرطان البروستاتا المقاوم الاخصاء، ولكن يمكن أن تكون مفيدة أيضا لأمراض أخرى.
Abstract
وقد تبين الحمض الحر خلية البلازما والمصل (كفدنا) كمصدر للمعلومات، وغير الغازية من المؤشرات الحيوية لتشخيص مرض السرطان والتشخيص والرصد والتنبؤ بمقاومة العلاج. بدءاً من فرضية أن الحصول على الاندروجين الجينات مستقبلات (ع) نسخة رقم (CN) حدث متكرر في الاخصاء المنتشر مقاومة سرطان البروستاتا (مكربك)، ونقترح لتحليل هذا الحدث في كفدنا كالعلامات البيولوجية تنبؤية محتملة.
نحن تقييم CN ع في كفدنا استخدام فحوصات PCR الوقت الحقيقي مختلفة 2 و 2 إشارة الجينات (رناسيب و آغو1). كمية الحمض النووي من 60 استخدمت نانوغرام لكل تركيبة الإنزيم. AR وأكد مكسب CN استخدام PCR الرقمية كوسيلة أكثر دقة. تحليل التباين CN وقد ثبت بالفعل أن تكون مفيدة للتنبؤ بمقاومة العلاج في وضع مكربك، ولكن قد يكون من المفيد أيضا لأغراض أخرى في مختلف البيئات المريض. تحليل CN في كفدنا مزايا عديدة: غير الغازية وسريعة وسهلة لتنفيذ، ويبدأ من كمية صغيرة من المواد المصل أو البلازما.
Introduction
تعميم الخلية الحرة الحمض النووي (كفدنا) في الدم قد ثبت أن مصدر أمثل للمؤشرات الحيوية لتشخيص مرض السرطان والتشخيص والرصد والتنبؤ بمعاملة المقاومة1،2. وقد أظهرت العديد من الدراسات توافق جيد بين التعديلات الحمض النووي (الطفرات، نسخ عدد الاختلافات، تعديلات جينية في الأنسجة) وتلك التي عثر عليها في المقابل البلازما عينات1، تؤكد أن تعميم الورم الحمض النووي (كتدنا) مفيدة للورم الابتدائي والمنتشر الأنسجة التعديلات3. وبالتالي يتيح إمكانية دراسة كتدنا لإعادة بناء الجينومي ترتيبات جديدة والاختلافات (كنفس) نسخة رقم المسرطنة محددة4، تحديد خلايا الاستنساخ وسوبكلونال يحتمل أن المنتشر. وقد ثبت كتدنا سريرياً مفيدة خاصة لرصد علاج السرطان كما أنها تؤوي طفرات محددة وكنفس، المتعلقة بالعلاجات المستهدفة المحددة5،6. كما يتغلب على الحاجة خزعات الأنسجة ويسمح للنتائج يمكن الحصول عليها في أوقات مختلفة أثناء علاج سرطان محددة بطريقة غير الغازية.
فيما يتعلق بسرطان البروستاتا، ارتباط كبير بين تعميم الاندروجين خالية من الخلايا مستقبلات (ع) كنفس والعلاج استجابة ل abiraterone وانزالوتاميدي وقد ثبت، قد تكون تشير إلى AR الجينات عدد النسخ (CN) في كفدنا العلامات البيولوجية واعدة قادرة على التنبؤ بمعاملة المقاومة7،،من89،10،11. يمكن تقييم كنفس جينات محددة في كتدنا باستخدام نهج مختلفة مع حساسية مختلفة، والتكلفة، وسرعة (على سبيل المثال. بكر في الوقت الحقيقي، والرقمية، وتسلسل الجيل القادم).
هنا يصف لنا نهجاً بسيطاً وسريعا، استناداً إلى فحوصات مزدوجة في تكنولوجيا PCR الوقت الحقيقي، لتقييم CN ع في كفدنا من المصل والبلازما عينات7،8. ونحن نظر اثنان فحوصات PCR مختلفة مصممة في منطقتين مختلفتين من الجينوم داخل إنترون 5 ع (Xq12) واثنين من الجينات الأخرى، كمرجعية معيارية داخلية الجينات يعرف أن لها وضعا رقم نسخة عادية في سرطان البروستاتا (رناسيب، يقع في 14q11؛ قبل1، الموجود على 1 ف 34). نحن تحديد الجينات مرجعيتين، بدلاً من واحدة، زيادة الدقة والحساسية للنتائج. كمية الحمض النووي من 60 تم تضخيمه نانوغرام لكل تركيبة الإنزيم (مقايسة مجتمعة AR-assay_1 + رناسيب ول ع-assay_2 + AGO1). تجميع ثلاث عينات الحمض النووي المصل أو البلازما من الذكور الأصحاء وتستخدم معايرة. أننا اعتبرنا قطع من > 1.5 لكسب ع و < 0.5 للحذف. واحدة من المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها مرنة وأن جينات أخرى يمكن أيضا تقييم، تغيير الجينات القياسية المرجعية الداخلية، استناداً إلى نوع الورم وخصائصها.
Protocol
Representative Results
Discussion
AR تحليل CN في عينة مصل وبلازما يمثل نهجاً جديداً غير الغازية للتقسيم الطبقي لمرضى سرطان البروستاتا المقاوم الاخصاء (قانون الإجراءات الجنائية). وقد ثبت مؤخرا أن CN ع غير قادرة على التنبؤ بالنتائج في قانون الإجراءات الجنائية المرضى الذين عولجوا مع abiraterone وانزالوتاميدي، قبل وبعد الع?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر كيارا موليناري وفيليبو مارتيجنانو لتقديم الدعم في مجال تحليل البيانات.
Materials
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | – | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | – | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | – | Software for copy number analysis |
Referencias
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
- Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
- Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
- Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
- Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
- Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).
