Summary

סרום ו פלזמה עותק מספר זיהוי באמצעות PCR בזמן אמת

Published: December 15, 2017
doi:

Summary

כתב יד זה מתאר את עותק מספר וריאציה ניתוח שבוצעה ב- DNA סרום או פלסמה, באמצעות גישה PCR בזמן אמת. שיטה זו מתאימה נבואתו של עמידות לתרופות בחולי סרטן הערמונית עמיד סירוס, אבל זה יכול להיות אינפורמטיבי גם למחלות אחרות.

Abstract

סרום ותא פלזמה DNA חופשי (cfDNA) הוכח כמקור אינפורמטיבי, לא פולשנית של סמנים אבחון סרטן, הפרוגנוזה, ניטור של חיזוי של עמידות לטיפול. החל מההיפותזה אנדרוגן קולטן (AR) ג’ין עותק מספר (CN) לזכות הינו אירוע תכופים סירוס גרורתי עמידות סרטן הערמונית (mCRPC), אנו מציעים לנתח אירוע זה ב- cfDNA כמו סמן ניבוי פוטנציאליים.

אנחנו הערכה CN AR ב- cfDNA באמצעות 2 מבחני ה-PCR שונים בזמן אמת ו- 2 גנים התייחסות (RNaseP לפני1). כמות ה-DNA של 60 ng שימש עבור כל שילוב וזמינותו. AR CN רווח אושר באמצעות PCR דיגיטלית כמו שיטה מדויקת יותר. CN וריאציה ניתוח כבר הוכח כדי להיות אינפורמטיבי לחיזוי ההתנגדות טיפול בסביבה של mCRPC, אבל זה יכול להיות שימושי גם למטרות אחרות בהגדרות שונות של המטופל. CN ניתוח על cfDNA יש כמה יתרונות: זה לא פולשנית, מהירה וקלה לביצוע, זה מתחיל מאמצעי אחסון קטן של חומר סרום או פלסמה.

Introduction

במחזור התא DNA חופשי (cfDNA) בדם הוכח להיות מקור אופטימלי של סמנים אבחון סרטן, הפרוגנוזה, ניטור של חיזוי של טיפול ההתנגדות1,2. מחקרים רבים הוכיחו קונקורדנציה טוב בין DNA השינויים (מוטציות, העתק מספר וריאציות, שינויים epigenetic ברקמות) ואלה נמצאו המתאימים פלזמה דגימות1, המאשר כי במחזור הגידול דנ א (ctDNA) הוא אינפורמטיבי עבור שינויים רקמת הגידול העיקרי ולא גרורתי3. האפשרות של הלומדים ctDNA ובכך מאפשר את שיקומה של rearrangements גנומית, העתק מספר וריאציות (CNVs) oncogenes ספציפית4, זיהוי פוטנציאל גרורתי תאים המשובטים ו- subclonal. CtDNA הוכח כיעיל קלינית. במיוחד עבור סרטן טיפול ניטור כמו זה בנמלים מוטציות ספציפיות, CNVs, הקשורים ספציפית טיפולים ממוקדים5,6. גם הוא מתגבר על הצורך ביופסיות רקמות ומאפשר את תוצאות ניתן להשיג במועדים שונים במהלך טיפול בסרטן ספציפי בצורה לא פולשנית.

לגבי סרטן הערמונית, מובהק בין מחזורי ללא תא אנדרוגן קולטן (AR) CNVs וטיפול בתגובה abiraterone, enzalutamide הוכח, כמסמן AR ג’ין עותק מספר (CN) ב- cfDNA יכול להיות סמן המבטיחים יכולת חיזוי טיפול ההתנגדות7,8,9,10,11. CNVs של גנים ספציפיים ב- ctDNA ניתן להעריך באמצעות גישות שונות עם רגישות שונה, עלות במהירות (למשל-PCR בזמן אמת, דיגיטלי, קביעת רצף הדור הבא).

כאן נתאר בגישה פשוטה ומהירה, על סמך מבחני דופלקס בטכנולוגיית ה-PCR בזמן אמת, להערכת CN AR ב- cfDNA מסרום ופלסמה דגימות7,8. שקלנו שני מבחני ה-PCR שונה תוכנן על שני אזורים גנומית שונים בתוך אינטרון 5 של AR (Xq12), שני גנים אחרים, כמו גנים התייחסות תקן פנימי ידוע יש מצב מספר עותק נורמלי סרטן הערמונית (RNaseP, ממוקם על 14q11; לפני1, מלון ב 1 p 34). בחרנו גנים התייחסות שני, במקום אחד, כדי להגביר את הדיוק ואת הרגישות של התוצאות. כמות ה-DNA של 60 ng היה מוגבר עבור כל שילוב assay (assay משולב עבור AR-assay_1 + RNaseP , AR-assay_2 + AGO1). שלושה סרום או פלזמה דגימות דנ א גברים בריאים היו איחדו ומשמש כיל. שקלנו המכנסונים של > 1.5 לרווח AR , < 0.5 למחיקה. אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו הוא כי הוא גמיש וכי כי גנים אחרים גם ניתן להעריך, שינוי הגנים להפניה פנימית רגילה, על בסיס סוג הגידול ומאפיינים.

Protocol

הפרוטוקול מורכב הבידוד של דנ א מן הדוגמאות סרום או פלזמה לבצע PCR בזמן אמת לצורך ניתוח מספר עותק. הפקת דנ א, בקרת כמות ה-DNA (ספקטרופוטומטרים) ו- PCR בזמן אמת עבור מטרות ספציפיות בוצעו. איור 1, תקציר של נהלים, קו זמן מדווחים. הפרוטוקול מנחים את ועדת אתיקה במחקר IRST אנו?…

Representative Results

CfDNA הכולל ריכוז היה לכימות באמצעות ספקטרופוטומטר עבור כל הדגימות ניתח, מציג החציוני של 6.12 ng/µL (טווח: 2.00-23.71 ng/µL) ועבור הדוגמאות סרום החציוני של 3.21 ng/µL (טווח: 2.31-8.49 ng/µL) עבור דגימות פלסמה. ניתחנו את סך של דגימות 115 על ידי ניסויים PCR בזמן אמת. מבח?…

Discussion

AR ניתוח CN סרום ופלסמה מדגם מייצג גישה חדשה, לא פולשנית עבור השיכוב סירוס עמיד חולי סרטן הערמונית (CRPC). זה לאחרונה הוכח כי AR CN הוא מסוגל לחזות תוצאות CRPC חולים שטופלו abiraterone, enzalutamide, לפני ואחרי כימותרפיה7,8,9,10.

<p cla…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים מולינרי קיארה, פיליפו Martignano על תמיכה בניתוח נתונים.

Materials

BD Vacutainer Serum Tubes Becton Dickinson 367814 whole blood tube for serum
BD Vacutainer EDTA Tubes Becton Dickinson 366643 whole blood tube for plasma
Ethanol absolute VWR the user could use also other companies
TaqMan Copy Number assay Thermo Fisher Scientific 4400291 Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283
TaqMan Copy Number assay (modified) Thermo Fisher Scientific 4467084 Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn
TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P Thermo Fisher Scientific 4403326
TaqMan Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4326708 Master mix for Real Time PCR
QIAamp DNA Mini Kit (50) Qiagen 51304 DNA extraction kit
MicroAmp 96-Well Plates Thermo Fisher Scientific N8010560 plates for realt time PCR
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA
7500 Fast Real-Time PCR System Applied Biosystem the user could use also other real time instrument
CopyCaller Software Applied Biosystem Software for copy number analysis

Referencias

  1. Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
  2. Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
  3. Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
  4. Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
  5. Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
  6. Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
  7. Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
  8. Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
  9. Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
  10. Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
  11. Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
  12. Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
  13. Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).
check_url/es/56502?article_type=t

Play Video

Citar este artículo
Salvi, S., Conteduca, V., Martignano, F., Gurioli, G., Calistri, D., Casadio, V. Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR. J. Vis. Exp. (130), e56502, doi:10.3791/56502 (2017).

View Video