Modelo murino de inflamación inducida por Pentylenetetrazole

Summary

Este protocolo describe un método de química inflamación con pentylenetetrazole y proporciona un modelo de ratón de la epilepsia. Este protocolo también puede utilizarse para investigar la vulnerabilidad a la inducción de convulsiones y de la patogenesia después de las crisis epilépticas en los ratones.

Abstract

Pentylenetetrazole (PTZ) es un antagonista del receptor GABA-A. La inyección intraperitoneal de PTZ en un animal induce una convulsión aguda, severa a una dosis alta, mientras que las inyecciones secuenciales de una dosis de subconvulsive se han utilizado para el desarrollo de la química, Yesca, un modelo de epilepsia. Una sola inyección de dosis bajas de PTZ induce una convulsión leve sin convulsión. Sin embargo, repetidas inyecciones de dosis bajas de PTZ disminuyen el umbral para evocar un ataque convulsivo. Por último, la administración continua de dosis bajas de PTZ induce una severa convulsión tónico-clónica. Este método es simple y ampliamente aplicable a investigar la patofisiología de la epilepsia, que se define como una enfermedad crónica que involucra convulsiones repetitivas. Este producto químico Yesca protocolo causa convulsiones repetitivas en animales. Con este método, se estimó la vulnerabilidad a ataques de PTZ-mediada o el grado de agravación de las crisis epilépticas. Estas ventajas han llevado a la utilización de este método para la detección de drogas antiepilépticas y genes relacionados con la epilepsia. Además, este método se ha utilizado para investigar daño neuronal después de ataques epilépticos debido a los cambios histológicos observados en los cerebros de pacientes epilépticos también aparecen en los cerebros de animales encendido química. Así, este protocolo es útil para la producción conveniente de modelos animales de epilepsia.

Introduction

La epilepsia es un trastorno neurológico crónico que se caracteriza por convulsiones recurrentes y afecta aproximadamente al 1% de las personas. Los mecanismos subyacentes de generación epileptogénesis y convulsiones en pacientes con epilepsia no pueden ser totalmente clarificados en estudios clínicos. Por lo tanto, un modelo animal apropiado es necesario para el estudio de la epilepsia¹.

Una gran variedad de modelos animales de epilepsia se han utilizado para investigar la fisiología de la epilepsia y para identificar los fármacos antiepilépticos^2,3. Entre estos modelos, la inducción de convulsiones farmacológicas es un método común utilizado para generar un modelo animal para la investigación de la patología de la epilepsia⁴. Este método es barato y simple. Inflamación mediada por electrodo es también un método comúnmente utilizado, pero los costos de este procedimiento son más altos, y el método requiere habilidades quirúrgicas y eléctricos para inducir convulsiones repetitivas⁵.

Inducción farmacológica también es ventajosa porque el tiempo y el número de convulsiones se controlan fácilmente. Modelos de ratón genético que presentan convulsiones espontáneas también se utilizan en el estudio de la epilepsia. Sin embargo, la predicción de Cuándo y con qué frecuencia las convulsiones se presentan en estos modelos genéticos puede ser imposible⁶. Un sistema de seguimiento es necesario para observar el comportamiento epiléptico de ratones modificados genéticamente⁶.

Ácido kaínico, la pilocarpina y la pentylenetetrazole (PTZ) son ampliamente utilizados como inductores de incautación drogas⁷. El Ácido kaínico es un agonista de los receptores de glutamato, y pilocarpina activa los receptores colinérgicos. PTZ es un ácido gamma aminobutírico (GABA)-un antagonista del receptor del⁸. PTZ suprime la función de las sinapsis inhibitorias, una mayor actividad neuronal. Presente Reglamento causa asimientos generalizados en animales⁹. Una sola inyección de Ácido kaínico y pilocarpina puede inducir convulsiones agudas, especialmente status epiléptico (SE)^10,11 y kaínico ácido o pilocarpina-mediada SE promueve crónica espontánea y recurrente asimientos^{12 , 13}. las grabaciones electroencephalographic (EEG) y análisis de la conducta han indicado que las crisis recurrentes espontáneas se observan un mes después de una sola inyección^12,13. Una sola inyección de una dosis convulsiva de PTZ también induce crisis aguda. Sin embargo, asimientos crónicos espontáneos después de una inyección única de PTZ son difíciles de promover. La administración crónica de PTZ es necesaria para inducir convulsiones repetitivas¹⁴. En cualquiera de los métodos, la generación de convulsiones repetitivas es capaz de inducir una patología más similar a la de la epilepsia humana que la generación de convulsiones agudas. En el caso de PTZ, cada inyección evoca una convulsión, y severidad de la crisis se convierte en más grave en una manera paso a paso con cada inyección. Por último, una sola inyección de PTZ de dosis bajas induce una severa convulsión tónico-clónica. En esta fase, cada inyección evoca las convulsiones severas. Además, la latencia de la convulsión y la duración también cambian en el transcurso de las inyecciones. La latencia a asimiento tónico se convierte a menudo más corta en esta última fase de inflamación¹⁵. Además, agravamiento de la convulsión se acompaña de una convulsión prolongada duración¹⁶. Investigar el mecanismo molecular que regula la gravedad de la crisis, latencia y duración es útil para la detección de drogas antiepilépticas^17,18,19.

Comúnmente los asimientos son inducidos por una sola administración sistémica de PTZ y la recuperación es muy rápida, dentro de 30 min^4,5. Así, el número de las convulsiones es más controlable en el modelo PTZ-astillas. Sin embargo, la supervisión de EEG ha indicado que pueden verse picos generalizadas hasta 12 h después de PTZ-medió incautación²⁰. Por lo tanto, los animales preferiblemente deben permanecer bajo observación durante 24 h después de las convulsiones mioclónicas o tónico²¹ para análisis más preciso de los mecanismos de inflamación.

La administración de los fármacos antiepilépticos, como la etosuximida, valproato, fenobarbital, vigabatrina y retigabine³, antes o después de la inyección de PTZ mitiga el agravamiento de la convulsión severidad^{3,22, 23}. Asimismo, ratones knockout que falta genes implicados en la exacerbación de convulsiones, como matriz metaloproteinasa-9²⁴,²⁵ y neuritin FGF-22²⁶, han demostrado exhibir convulsiones reducida gravedad después de inyecciones múltiples de PTZ. Además, observando alteraciones histopatológicas después de las crisis epilépticas es posible con este método. En pacientes con epilepsia del lóbulo temporal, hay cambios histológicos típicos en el cerebro, como la fibra musgosa brotación^27,28, gránulo anormal neurona migración²⁹, astrogliosis³⁰, células neuronales muerte en el hipocampo^31,32y esclerosis hipocampal³³. Cambios similares se observan en animales epilépticos modelo. Entre los métodos disponibles, inflamación química mediada por PTZ es un método bueno, reproducible y barato para producir un modelo animal de epilepsia. En un modelo SE mediada por pilocarpina, control de las convulsiones es difícil y muchos ratones mueren o no a desarrollar SE³⁴. En contraste, la mortalidad y la gravedad de la crisis son más controlables en el modelo PTZ. Además, PTZ es menos costoso que el Ácido kaínico y habilidades en cirugía de cerebro de ratón no son necesarios para la administración de la droga.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el cuidado Animal y uso de la Tokyo Metropolitan Instituto de ciencias médicas. 8 postnatal – ratones de 16 semanas de edad se recomiendan. Cualquier cepa consanguínea es aceptable para el experimento. Ratones C57BL/6 son más resistentes a PTZ, que ratones albinos BALB/c y Suiza son más sensibles a PTZ. C57BL/6 fueron utilizados en este estudio. Vulnerabilidad a PTZ también depende de la edad del ratón. En comparación con ratones pequeños, ratones más …

Representative Results

Inyección repetitiva de PTZ induce un aumento en la severidad de convulsiones. Seis ratones C57BL/6 fueron tratados con PTZ, y otro 6 ratones fueron tratados con solución salina como grupo de control. La dosis PTZ fue de 35 mg/kg, y 10 inyecciones fueron administradas. La puntuación de ataque aumentó gradualmente con inyecciones de PTZ, considerando que no hay ataques o comportamientos anormales fueron evocados por las inyecciones de solución Salinas (figura 2</s…

Discussion

Aquí, presentamos un protocolo ampliamente accesible para el establecimiento de un modelo farmacológico de la epilepsia. Inflamación química mediada por PTZ tiene una larga historia y es un modelo comúnmente aceptado para el estudio de la patología celular y la histopatología de epilepsia⁴¹. El modelo de inflamación química de la epilepsia ha sido revisado previamente por Suzdak y Jansen, 1995⁴². Inducción de convulsiones farmacológicas, especialmente con PTZ, es…

Materials

Pentylenetetrazole	Sigma-Aldrich	P6500
Sodium chloride	MANAC	7647-14-5
Mouse	CLEA Japan		C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL)	Terumo	SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm)	Terumo	NN-2719S
Weighing scale	Mettler	PE2000	This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium hydroxide	nacalai tesque	31511-05
Peristatic pump	ATTO	SJ1211
Sucrose	nacalai tesque	30404-45
Microtome	Yamato	REM-700	This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade	Feather	S35
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
anti-synaptoporin antibody	Synaptic systems	102 002
anti-ZnT3 antibody	Synaptic systems	197 002
anti-doublecortin	Santa Cruz	sc-8066	This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus	O'hara
Three chamber test apparatus	Muromachi