דגם העכבר מתמצקים הנוצרות על-ידי Pentylenetetrazole

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה של הצתה כימי עם pentylenetetrazole ומספק דגם העכבר של אפילפסיה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לחקור את הפגיעות פרכוס אינדוקציה, פתוגנזה לאחר התקפים אפילפטיים בעכברים.

Abstract

Pentylenetetrazole (PTZ) הוא אנטגוניסט קולטן GABA-A. זריקה בקרום הבטן של PTZ לחיה המניע של התקף אקוטי, חמור במינון גבוה, בעוד זריקות רציפים של מנה subconvulsive שימשו לפיתוח כימית מוצתים, מודל אפילפסיה. זריקה אחת במינון נמוך של PTZ גורם התקף קל ללא עווית. עם זאת, חוזרות זריקות במינון נמוך של PTZ להקטין את הסף לעורר התקף עוויתי. לבסוף, במינון נמוך מתמשך, מינהל PTZ גורם של תפיסה clonic חמורה. שיטה זו היא פשוטה, החלים נרחב לחקור הפתופיזיולוגיה של אפילפסיה, אשר מוגדרת כמחלה כרונית המערבת התקפים חוזרים. הכימי מוצתים פרוטוקול גורמת להתקפים חוזרים אצל בעלי חיים. בשיטה זו, הוערך פגיעות בתיווך PTZ התקפים או מידת ההחמרה של התקפים אפילפטיים. יתרונות אלה הובילו השימוש בשיטה זו לסינון סמים אנטי-אפילפטי, גנים הקשורים אפילפסיה. בנוסף, שיטה זו שימש לחקור נזקים עצביים לאחר התקפים אפילפטיים, בגלל השינויים היסטולוגית במוחם של חולי אפילפסיה להופיע גם במוחם של חיות כימית-כיליון. לפיכך, פרוטוקול זה שימושי להפקת בנוחות מודלים חייתיים של אפילפסיה.

Introduction

אפילפסיה היא הפרעה נוירולוגית כרונית זה מאופיין על-ידי התקפים חוזרים ונשנים ומשפיע כ- 1% של אנשים. המנגנונים שבבסיס הדור epileptogenesis ותפיסה בחולי אפילפסיה לא יכול להיות מובהר מלא במחקרים קליניים. לכן, מודל חיה המתאימה נדרש לצורך המחקר של אפילפסיה¹.

מגוון רחב של מודלים חייתיים של אפילפסיה שימשו כדי לחקור את הפיזיולוגיה של אפילפסיה וכדי לזהות תרופות אנטי-אפילפטי^2,3. בין אלה מודלים, תפיסת תרופתי אינדוקציה הוא שיטה נפוצה המשמשת ליצירת מודל חיה על החקירה של הפתולוגיה של אפילפסיה⁴. שיטה זו היא פשוטה וזולה. הצתה בתיווך אלקטרודה היא גם שיטה בשימוש נפוץ, אבל העלויות של הליך זה הן גבוהות יותר, השיטה דורשת מיומנויות כירורגית, חשמליים כדי לגרום להתקפים חוזרים⁵.

אינדוקציה תרופתי יש יתרון גם כי התזמון ואת מספר התקפים נשלטים בקלות. מודלים העכבר גנטי כי התערוכה התקפים ספונטנית משמשים גם במחקר של אפילפסיה. עם זאת, לחזות מתי ובאיזו תכיפות ההתקפים עולות דגמים גנטיים אלה עשוי להיות אפשרי⁶. מערכת ניטור נדרש כדי לצפות את ההתנהגות אפילפטיים של עכברים מהונדסים⁶.

חומצה Kainic, פילוקרפין ו- pentylenetetrazole (PTZ) נמצאים בשימוש נרחב כמו גרימת התקף תרופות⁷. חומצה Kainic הוא אגוניסט עבור רצפטורים גלוטמט, ומפעילה פילוקרפין קולטנים שימוש. PTZ הוא גמא בוטירית (GABA)-אנטגוניסט קולטני⁸. PTZ מעלימה את הפונקציה של הסינפסות מעכבות, שמוביל פעילות. עצבית מוגברת. תקנה זו גורמת מוכללת ויהיו בעלי חיים⁹. זריקה אחת של חומצה kainic, פילוקרפין יכול לגרום להתקפים חריפה, במיוחד סטטוס אפילפטיקוס (SE)^10,11 ומקדם kainic חומצה או פילוקרפין-בתיווך SE התקפים ספונטנית ולא חוזרים ונשנים כרונית^{12 , 13}. הקלטות electroencephalographic (EEG) וניתוח התנהגות הראו כי התקפים חוזרים ונשנים ספונטנית שנצפו חודש אחרי^12,13זריקה בודדת. זריקה אחת של מנה עוויתית של PTZ גורם גם התקף אקוטי. עם זאת, התקפים ספונטנית כרונית לאחר זריקה אחת של PTZ קשים לקדם. ממשל כרונית של PTZ נדרש כדי לגרום להתקפים חוזרים¹⁴. בשיטה אחת, הדור של התקפים חוזרים הוא מסוגל לגרום מחלה דומה יותר לזה של אפילפסיה האנושית מאשר בדור של התקפים חריפה. במקרה של PTZ, כל זריקה מעורר התקף, חומרת ההתקף הופכת קשה יותר בצורה stepwise עם כל זריקה. לבסוף, זריקה אחת של PTZ במינון נמוך גורם של תפיסה clonic חמורה. בשלב זה, כל זריקה מעורר התקפים חמורים. בנוסף, תפיסת השהיה והמשך גם להשתנות לאורך המסלול של הזריקות. ההשהיה לתפיסה טוניק לעתים קרובות הופך קצר יותר בשלב האחרון של בני¹⁵. יתר על כן, עוגמת נפש ההתקף מלווה משך התקף ממושך¹⁶. חוקרים את המנגנון המולקולרי המסדיר את חומרת ההתקף, השהיה, ומשך שימושית הקרנת סמים אנטי-אפילפטי^17,18,19.

התקפים הם בדרך כלל המושרה על ידי ניהול מערכתי יחידה של PTZ, ההחלמה היא מהירה מאוד, במרחק של 30 דקות^4,5. לכן, מספר התקפים הוא יותר לשליטה במודל PTZ-הסקה. עם זאת, ניטור EEG ציין כי קוצים מוכללת, ניתן לראות עד 12 שעות לאחר ההתקף בתיווך PTZ²⁰. לכן, בעלי חיים צריכים רצוי להישאר בהשגחה במשך 24 שעות לאחר ההתקף מיוקלונית או טוניק²¹ לניתוח מדויק יותר של מנגנוני הצתה.

הממשל של תרופות אנטי-אפילפטי, כגון ethosuximide, valproate, פנוברביטל, vigabatrin ו- retigabine³, לפני או אחרי הזרקת PTZ מפחית את הסיכון של העצבים של תפיסת חומרת^{3,22, 23}. באופן דומה, עכברים knockout כי חוסר גנים מעורבים החרפה התקף, כגון מטריקס מטאלו-פרוטאינאז-9²⁴, FGF-22²⁵ ו- neuritin²⁶, הוכחו שהפגינו חומרת ההתקף מופחתת לאחר זריקות PTZ מרובים. בנוסף, צופה שינויים histopathological לאחר התקפים אפילפטיים אפשרי בשיטה זו. בחולים עם אפילפסיה, ישנם שינויים היסטולוגית טיפוסי במוח, כגון סיבים מוסי הלבלוב דופאמינרגיים astrogliosis³⁰, גרגר חריג נוירון ההעברה²⁹,^27,28 מוות ההיפוקמפוס^31,32ולאחר טרשת בהיפוקמפוס³³. שינויים דומים הם נצפו בחיות מודל אפילפטיים. בין השיטות הזמינות, בתיווך PTZ הצתה כימי היא שיטה טובה, הדירים זול לייצר במודל חיה של אפילפסיה. במודל בתיווך פילוקרפין SE, תפיסת השליטה קשה, עכברים רבים מתים או לא מצליחים לפתח SE³⁴. לעומת זאת, התמותה, חומרת ההתקף הם יותר לשליטה במודל PTZ. בנוסף, PTZ הוא זול יותר מאשר חומצה kainic, מיומנויות ניתוח מוח העכבר אינם הכרחיים לצורך והתרופות האמריקני.

Protocol

כל ההליכים ניסיוני אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה של טוקיו מטרופוליטן המכון הרפואי למדע. 8 לאחר הלידה – מומלץ בן 16 בשבוע עכברים. כל זן המפגרים מקובל לניסוי. C57BL/6 עכברים הם עמידים יותר בפני PTZ, ואילו עכברים לבקן BALB/c ושווייץ רגישים יותר PTZ. C57BL/6 השתמשו במחקר זה. פגיעות PTZ תלויה גם הגיל ש?…

Representative Results

הזרקה חוזרות של PTZ גורם לעלייה בחומרתן התקף. 6 C57BL/6 עכברים שטופלו PTZ, עוד 6 עכברים שטופלו תמיסת מלח כקבוצת בקרה. המינון PTZ היה 35 מ”ג/ק”ג, 10 זריקות נוהלו. הציון התקף גדל בהדרגה עם זריקות PTZ, ואילו ללא התקפים או התנהגויות חריגות ולעוצמת על ידי זריקות מלוחים (איור 2). …

Discussion

כאן, אנו מציגים פרוטוקול נגישים נרחב להקמתה של מודל בעלי חיים תרופתי של אפילפסיה. בתיווך PTZ הצתה כימי היסטוריה ארוכה, הוא מודל שהנוהג המקובל עבור המחקר של פתולוגיה histopathology וסלולר של אפילפסיה⁴¹. הדגם הצתה כימי של אפילפסיה נצפה בעבר על-ידי Suzdak ג’נסן, 1995⁴². אינדוקציה פר?…

Materials

Pentylenetetrazole	Sigma-Aldrich	P6500
Sodium chloride	MANAC	7647-14-5
Mouse	CLEA Japan		C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL)	Terumo	SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm)	Terumo	NN-2719S
Weighing scale	Mettler	PE2000	This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium hydroxide	nacalai tesque	31511-05
Peristatic pump	ATTO	SJ1211
Sucrose	nacalai tesque	30404-45
Microtome	Yamato	REM-700	This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade	Feather	S35
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
anti-synaptoporin antibody	Synaptic systems	102 002
anti-ZnT3 antibody	Synaptic systems	197 002
anti-doublecortin	Santa Cruz	sc-8066	This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus	O'hara
Three chamber test apparatus	Muromachi