Détection et Quantification de Plasmodium falciparum dans aqueux globules rouges par atténuée totale réflexion spectroscopie infrarouge et analyse de données
Summary
Nous présentons ici un protocole pour la détection et la quantification de Plasmodium falciparum infectés aqueuse globules rouges à l’aide d’un spectromètre infrarouge de la réflexion totale atténuée et analyse de données multivariées.
Abstract
Nous démontrons une méthode de dosage et détection des parasites en solution aqueuse des globules rouges (hématies) en utilisant une simple paillasse atténuée totale réflexion Fourier Transform (IRTF) spectromètre infrarouge conjointement avec (analyse de données LCVA). 3 7 P. falciparum ont été cultivés à 10 % parasitémie anneau stade des parasites et utilisé pour doper les globules rouges fraîches donateur isolé afin de créer une dilution série entre 0 – 1 %. 10 µL de chaque échantillon ont été placés au centre de la fenêtre de diamant de RTA pour acquérir le spectre. Les exemples de données a été traitées afin d’améliorer le rapport signal sur bruit et à supprimer la contribution de l’eau, et alors la dérivée seconde a été appliquée pour résoudre des caractéristiques spectrales. Les données ont été ensuite analysées à l’aide de deux types de LCVA : première analyse de composantes principales (ACP) pour déterminer les valeurs aberrantes puis régression des moindres carrés partiels (PLS-R) pour construire le modèle de quantification.
Introduction
Le paludisme est parmi les maladies les plus dévastatrices de notre époque ; plus de la moitié de la population vit en péril dans les régions d’endémie et il pèse disproportionnellement faible1,2,3,4. Une grande partie de la question est les porteurs asymptomatiques et tôt les patients de stade qui agissent comme des réservoirs de moustiques vecteurs5, causant des pointes d’infection au cours de la saison humide et ce qui lui permet de persister dans les collectivités. Le paludisme est causé par des parasites Plasmodium cinq, la plus meurtrière dont est à P. falciparum , qui provoque la forme la plus sévère de la maladie2.
Actuellement, les techniques pour le diagnostic du paludisme sont loin d’être parfaites. La microscopie optique, la norme actuelle de l’or, peut seulement détecter 62-88 parasites/µL selon la méthode utilisée6. En outre, en raison de la forte intensité et hautes compétences requises, dans nombreuses régions microscopie échogrammes > 50 % des cas, en particulier ceux avec faible parasitémie niveaux2, qui sont directement attribuables au manque de ressources dans le domaine et les résultats en l’utilisation abusive de médicaments antipaludiques. Les 2 autres méthodes diagnostiques principales sont des Tests de Diagnostic rapide (TDR), qui utilisent des anticorps pour la détection et des essais de réaction en chaîne de la polymérase (PCR), qui discriminent et quantifier les parasites de l’ADN. Actuellement, les TDR sont seulement capables de détecter P. falciparum et P. vivax d’au moins 100 parasites/µL de sang résultant en des formes plus rares de la maladie étant non traitée. 7 , 8 en revanche, tests de PCR discriminer et quantifier les différentes espèces de Plasmodium à une sensibilité de 0,0004-5 parasites/µL de sang. Toutefois, elle nécessite des réactifs coûteux, des équipements et des compétences techniques et n’est donc pas approprié pour l’application sur le terrain.
Une technique très sensible, fiable et abordable est essentielle pour améliorer les temps de diagnostic et ainsi améliorer les résultats pour les patients et permettant l’élimination de la maladie. Atténué totale réflexion spectroscopie transformée de Fourier (IRTF) offre une solution à ce problème. Travaux antérieurs ont montré qu’il était possible de détecter et de quantifier à P. falciparum dans le méthanol fixé des frottis sanguins, atteindre les limites de détection de < 1 parasite/µL de sang (< 0,0002 % parasitémie)9, qui est comparable aux méthodes PCR. Des études récentes ont montré qu’il est possible de détecter et quantifier des parasites dans des échantillons aqueux et ainsi éliminer l’étape de fixation. Cependant, des facteurs tels que la vapeur d’eau, le bruit spectrale et traitement des données doivent être prises en considération pour des résultats optimaux,10.
Ce protocole vise à montrer aux nouveaux utilisateurs comment acquérir des spectres IRTF- et préparer un modèle de régression pour la détection de P. falciparum d’aqueux d’échantillons de globules rouges (RBC)10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modèle PLS-R est une méthode multivariée encadrée qui trouve une relation linéaire, Y = bX + E, entre les variables prédictives X (ici, l’absorbance à chaque nombre d’onde) et une variable continue Y (ici, le niveau de la parasitémie). En bref, le modèle combine les variables x pour créer un nouvel ensemble de variables latentes (LVs) qui captent la variance sur X en corrélation avec Y et calcule un vecteur de régression (b) qui a multiplié par un nouveau résultats de spectre dans l’estimation de la v…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs a été financé par l’Australian Research Council (Future bourse FT120100926 à BRW), National Health and Medical Research Council of Australia, (programme de subventions et de bourse de recherche Senior à JGB ; Bourses de carrière précoce JSR ; Infrastructure de recherche des instituts de subvention de régime de soutien à l’Institut Burnet), et le soutien de l’Infrastructure opérationnelle du gouvernement Victorien État subvention à l’Institut Burnet. Nous remercions M. Finlay Shanks pour soutien instrumental.
Materials
| Donor blood | – | – | Must be collected by a trained medical practitioner |
| Stock blood | Australian Red Cross` | – | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet Institute | – | Laboratory strain wild type equivalent |
| RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Must be filtered before use in culture |
| Blood collection tubes (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Immersion Oil | Thermofisher | M3004 | |
| 50 mL culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 25mL pipette tips | Falcon | 357515 | |
| 10mL pipette tips | Falcon | 357530 | |
| Microscope Slides | Sigma Aldrich | S8902 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Automated pipette controller | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens |
| Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing |
| Matlab | Mathworks Inc | Multivariate data analysis software | |
| The Unscrambler X | CAMO | Multivariate data analysis software | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI for Matlab |
Referencias
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